三叶木通花粉前纤维蛋白基因的克隆与表达

以三叶木通花蕾为材料,采用RT-PCR、3-′RACE方法克隆了三叶木通花粉前纤维蛋白基因,命名为Atf-Pro(GenBank登录号GQ478584)。结果表明:AtfPro的cDNA全长735 bp、阅读框393 bp、编码131个氨基酸,有1个342 bp的3′端非翻译区。预测分子量约为14.081 kD,等电点4.74。氨基酸和核苷酸序列的同源性分析发现,AtfPro基因属于植物花粉profilin基因家族的新成员。RT-PCR定性分析表明,AtfPro基因在三叶木通花蕾、花药、雌花花瓣和柱头组织中均有表达,但在幼叶、茎尖、根尖组织中低水平表达或不表达,生殖器官中的表达时期从花序分化发育开始到开花散粉结束。     

苎麻植物螯合肽合成酶(BnPCS1)基因的克隆和表达

根据苎麻转录组测序中的PCS基因片段,利用RT-PCR结合RACE技术从中苎1号中克隆获得了该基因的全长cDNA序列,命名为BnPCS1。该基因的cDNA序列全长为1956 bp,其中开放读码框长1512 bp,编码503个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为56.02 kD和7.01。与长喙田菁(ACT87974)、百脉根(Q2TSC7)、狼牙刺(AFM38979)、荷花(BAN08523)和杜梨(AEY68568)的PCS氨基酸序列相似性分别为74%、73%、75%、73%和77%。荧光定量PCR分析表明,BnPCS1在根、茎、茎尖、幼叶、成熟叶中均有表达,其中在成熟叶中的表达量最高,茎中表达量最低,并且该基因受镉和ABA诱导上调表达。BnPCS1基因的克隆将为苎麻抗重金属分子育种和进一步的功能分析奠定基础。     

苎麻抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆和表达分析

本研究根据苎麻转录组测序结果中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）的基因片段,利用RT-PCR结合RACE方法从苎麻（Boehmeria nivea L.）中克隆到一个APX基因的全长cDNA,命名为BnAPX1。BnAPX1 cDNA全长1 201 bp,开放阅读框(ORF)为870 bp,推测其编码一个含289个氨基酸序列的多肽。生物信息学分析表明,BnAPX1属于植物过氧化物酶超家族成员,与其他物种过氧化物酶体APX相似性较高,C端具1个跨膜区。荧光定量PCR结果表明,BnAPX1在苎麻的根、茎中段、茎尖、茎皮、幼叶各部位均有表达,其中幼叶表达量最高,且该基因BnAPX1受重金属镉诱导上调表达,可能在重金属镉胁迫防御中起重要作用。     

苎麻纤维素合酶基因BnCesA1全长cDNA的克隆与表达分析

苎麻是中国的传统纤维作物,能够生产最长的自然纤维。本研究旨在克隆苎麻纤维素合酶基因BnCesA1全长编码序列,对其表达模式进行分析。以已知的苎麻纤维素合酶基因序列(DQ077190)为基础,设计5’RACE引物,以湘苎三号为材料,得到了BnCesA1的5’端,拼接后得到了BnCesA1的全长序列,并从湘苎三号的cDNA中成功克隆到包括BnCesA1全部编码序列的cDNA序列。扩增得到的BnCesA1基因cDNA为3253bp,编码区3246bp,编码含1082个氨基酸的多肽。通过对这个基因进行核酸序列和蛋白结构域分析表明,BnCesA1和毛果杨、欧美山杨、巨桉、大叶相思等其他物种的纤维素合酶基因都有很高的同源性,根据得到的BnCesA1的5’端设计特异性表达检测引物,分析其在湘苎三号苎麻品种各组织中的表达情况,结果显示BnCesA1在所检测的各组织中均有表达,表达量为茎皮>叶>顶芽>根。本研究首次克隆到苎麻中编码全长蛋白的纤维素合酶基因,并且苎麻BnCesA1在茎皮中高表达提示该基因可能在苎麻韧皮纤维合成中有重要作用。     

苎麻纤维素合酶BnCesA1高变区蛋白的原核表达与条件优化

高等植物纤维素合酶是含有多个功能结构域的糖苷转移酶,催化合成β-1 ,4葡萄糖苷链,即高等植物细胞壁的重要成分之一纤维素。在同一物种例如在拟南芥中比对纤维素合酶家族各成员的序列信息,发现其蛋白序列中存在两个高变异区域（HVR）,其中第一个HVR靠近NH2端（NHVR）,富含酸性氨基酸。本研究克隆了苎麻纤维素合酶基因（BnCesA1） 的NHVR编码序列,并以正确的阅读框亚克隆至含有6×His接头的pQE-N1原核表达载体,构建了pQE-N1-NHVR重组表达载体。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的重组蛋白His-tag-NHVR经Western-blotting验证后,正交优化得到该蛋白小量表达的最优条件组合为：所挑取的2号菌落在37 ℃下,IPTG的诱导浓度为0.1 mmol/L, 诱导表达4 hr。本研究结果为纯化His-tag-NHVR融合蛋白,制备其抗体及进一步研究苎麻纤维素合酶局部功能或其组织特异性作用打下基础。