水稻白叶枯病菌ahpC基因转录单元分析和原核表达

从水稻白叶枯病菌(Xanthomnas oryzae pv.Oryzae,Xoo)菌株PXO99A中克隆了H2O2降解基因ahpC,发现其编码的烷基过氧化氢酶AhpC在所测定的不同种病原细菌中的蛋白序列高度保守;采用RT-PCR方法分析了基因的转录结构特征,发现ahpC基因与酶电子供体基因ahpF组成了同一个转录单元;通过对ahpCp-lacZ活性检测,发现该启动子活性显著地受转录调控因子OxyR的正调控.此外,利用表达载体pET-28a(+)对ahpC基因进行了原核表达,经诱导后获得了可溶性的靶蛋白,可用于后续的生物学功能的分析.     

RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。     

水稻白叶枯病菌△rpfxoo基因缺失突变体DSF信号产生和毒性表达

[目的]旨在阐明3个DSF/Rpfxoo信号系统成员RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo在水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)毒性表达中的功能.[方法]用标记置换法缺失突变rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo基因,测定突变体及其互补菌株的DSF(diffusible signal factor)信号分子产生、胞外多糖(EPS)产生及其对水稻的致病性.[结果]从野生型菌株PX099A 基因组中克隆了推测与DSF信号生成和传导有关的基因rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo,获得了相应的单基因或双基因缺失突变体.与PX099A 产生DSF相比,△rpfFxoo、△rpfY+Cxoo和△rpfr+Gxoo均不产生DSF,△rpfCxoo过量产生,△rpfGxoo产量降低;rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo可以分别互补Xoo和Xce的相应基因突变体,恢复DSF产生表型.除△rpfFxoo的EPS产生无明显变化外,其余突变体的均显著减少.所有突变体对水稻的致病性均显著下降.[结论]RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo调控了Xoo的DSF信号生成、EPS产生和致病性.     

水稻白叶枯病菌TonB-Dep-Rec蛋白家族成员Tdrxoo的功能鉴定

【目的】旨在揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)致病性和运动性及其基因表达的调控途径。【方法】本研究通过基因克隆、序列分析和缺失突变方法,对与应答调节子GacAxoo互作的Tdrxoo的分子特征和功能进行了鉴定。【结果】利用序列特异性引物进行基因扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了tdrxoo基因。Tdrxoo与其它病原黄单胞菌的同源序列高度保守,具有TonB-Dependent-Receptor(TDR)结构域,推测其是位于细菌外膜、可能接收来自细菌体外环境信号的蛋白。用基因标记交换法,构建了△tdrxoo基因缺失突变体。与PXO99A相比,Δtdrxoo在人工培养条件下的生长受到影响,致病性完全丧失,胞外纤维素酶和木聚糖酶活性和运动能力显著减弱,基因互补可以使之恢复;Δtdrxoo嗜铁素产生无明显改变。【结论】Tdrxoo作为一种细胞外膜蛋白,可能参与调控了病菌的生长、致病性、胞外酶活性和运动性等表型。     

c-di-GMP信号途径对细菌致病性的调控作用

环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使。鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二脂酶(PDE)分别控制了c-di-GMP的合成和降解, 其中DGC活性由GGDEF结构域决定, PDE活性由EAL和HD-GYP结构域决定。c-di-GMP调控着细菌多种生物学功能, 抑制毒性因子产生和运动性, 促进生物膜形成。c-di-GMP下游是一个包括转录、翻译以及翻译后等多层次的复杂调控网络。本文结合本室有关水稻白叶枯病菌的研究结果, 综述近年来国内外在c-di-GMP研究领域的最新进展。     

病原物诱导型植物启动子的研究方法

植物启动子是控制基因转录的DNA序列之一,按其表达方法可分为组成型(或非特异性)表达和诱导型(或特异性)表达启动子两种类型.当受到病原物侵染时,植物通常通过诱导型启动子中的W-box、RAV1 AAT和WRKY等元件/位点、调控下游基因的表达,作出相应的应答反应.近年来,通过计算机预测与试验测定方法的有效结合,发掘和鉴定出了一些病原物诱导型启动子,并进行了调控功能的解析.此外,在通过转基因方法改良植物抗病性的途径中,利用病原物诱导型启动子可以实现对抗病功能相关基因表达的精准控制,避免由组成型启动子持续驱动基因表达、对植株本身带来的负效应.结合本室对水稻启动子OsBTF3-p的研究结果,重点对近年来国内外有关病原物诱导型启动子及其调控元件/位点的研究方法和应用进展作一综述.     

水稻白叶枯病菌Δrpfxoo基因缺失突变体DSF信号产生和毒性表达

【目的】旨在阐明3个DSF/Rpfxoo信号系统成员RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo在水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)毒性表达中的功能。【方法】用标记置换法缺失突变rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo基因,测定突变体及其互补菌株的DSF(diffusible signal factor)信号分子产生、胞外多糖(EPS)产生及其对水稻的致病性。【结果】从野生型菌株PXO99A基因组中克隆了推测与DSF信号生成和传导有关的基因rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo,获得了相应的单基因或双基因缺失突变体。与PXO99A产生DSF相比,ΔrpfFxoo、ΔrpfF+Cxoo和ΔrpfF+Gxoo均不产生DSF,ΔrpfCxoo过量产生,ΔrpfGxoo产量降低;rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo可以分别互补Xoo和Xcc的相应基因突变体,恢复DSF产生表型。除ΔrpfFxoo的EPS产生无明显变化外,其余突变体的均显著减少。所有突变体对水稻的致病性均显著下降。【结论】RpfFxoo、RpfCxoo和RpfGxoo调控了Xoo的DSF信号生成、EPS产生和致病性。     

一种定量分析水稻细胞过敏反应的方法

在定量分析水稻细胞过敏反应(HR)方法中,溴酚蓝染色法的效果明显优于伊文氏蓝染色法。线形回归分析显示,在0.625￣20ΜG·ML-1范围内的溴酚蓝最大光吸收值与其浓度间的相关系数为0.9994。溴酚蓝染色法优化的测定条件为:0.03%溴酚蓝染色15MIN,水洗去除未结合染料,再在50℃下用含50%甲醇和1%SDS抽提液抽提与死亡细胞结合的染料30MIN,测定抽提液光吸收值(OD595),以甲醇处理15MIN的细胞作为全杀死细胞参照。用优化方法测定的水稻细胞死亡率与实际死亡率一致。     

大麦黄矮病毒GPV外壳蛋白基因序列分析及其植物表达质粒的构建

大麦黄矮病毒GPV株系是我国特有的一个株系,与国外已报道的大麦黄矮病毒MAV,PAV,SGV,RPV和RMY在血清学上无反应.通过对GPV.外壳蛋白基因的序列分析,明确了病毒的外壳蛋白基因由603个核苷酸组成,编码201个氨基酸,分子量为22218ku.同MAV,PAV,RPV株系一样,在GPV外壳蛋白基因框架中(ORF)含有1个Vpg框架结构,分子量为17024ku.外壳蛋白基因序列同源性比较结果显示,GPV株系和RPV株系同源性较高,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83.7%和77.5%.而与PAV和MAV株系同源性较低,核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.9%,53.2%和44.1%,43.8%.按照GPV外壳蛋白基因序列,设计寡聚核苷酸引物,通过RT-PCR反应,得到GPV外壳蛋白基因全长cDNA,克隆到表达质粒,构建了高等植物表达载体pPPI1,pPPI2和pPPI5.     

转录调控因子OxyRxoo对水稻白叶枯病菌H2O2降解途径的调控作用

摘要：【目的】为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo)转录调控因子OxyRxoo对过氧化氢(H2O2) 降解途径的调控作用。【方法】本研究对推导的H2O2识别调控基因oxyRxoo进行了基因克隆、序列分析、缺失突变和互补试验及其相关表型的鉴定。【结果】克隆的oxyRxoo基因序列与其它几种病原黄单胞菌的同源序列高度保守。OxyRxoo是LysR家族成员之一,具有PBPb结构域和DNA结合保守结构域(HTH)。用标记交换法构建了△oxyRxoo基因缺失突变体。与野生型菌株PXO99A相比,尽管△oxyRxoo在离体培养条件下的生长无明显变化,但H2O2抗性显著地降低,过氧化物酶(CAT)活性明显下降,基因互补可以使之恢复; 过氧化物酶基因表达下调, oxyRxoo自身表达显著上调。【结论】OxyRxoo作为一个重要转录调控因子,调控了Xoo的 H2O2降解途径。