甲基对硫磷水解酶参与催化相关结构的研究

甲基对硫磷水解酶（MPH）是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因（mpd）构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在Escherichia coli DH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1, 10菲NFDA1啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定其金属含量显示MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn²⁺。为确定参与MPH催化活性的必需氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、磷酸吡哆醛和丁二酮处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h^-1,说明组氨酸是酶活力所必需的基团。这些结果为进一步研究酶的结构及对酶进行分子改造提供了必要的基础数据。     

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为（68.6 ± 5.1）μmol/L,kcat为（45 ± 6 ）S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为（59.5 ± 6.0）μmol/L,kcat为（8 ± 1） S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。     

污染土壤中有机磷农药降解菌的分离及其多样性

采用添加有机磷农药的选择性培养基,在长期受有机磷农药污染的土壤中分离到7株有机磷农药降解菌,经生理生化鉴定和系统发育分析,菌株mp-1鉴定为Pseudaminobactersp.,菌株mp-2为Alcaligenessp.,菌株mp-7为Brucellasp.,其他菌株为Ochrobactrumsp.。16SrDNA序列同源性比较、系统发育分析和染色体ERIC-PCR指纹图谱扩增表明有机磷农药长期污染的土壤中有机磷农药降解菌具有丰富的多样性。