利用Sed1p锚定蛋白在毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶及其应用

通过PCR扩增米黑根毛霉脂肪酶基因,在米黑根毛霉脂肪酶N端加入Flag标签。将米黑根毛霉脂肪酶基因与酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p基因的N端融合构建质粒pPIC9K-Flag-RML-Sed1,转化毕赤酵母GS115获得重组菌GS115/pPIC9K-Flag-RML-Sed1。重组菌经过甲醇诱导表达后,显微镜免疫荧光分析与流式细胞仪检测结果均证实米黑根毛霉脂肪酶已经成功展示在毕赤酵母上。该重组菌水解活力达到169.6U/g(Dry cell weight),在非水相中催化脂肪酸甲酯的合成,72h后脂肪酸甲酯的产率达82.36%。     

以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型的建立

根据嗜杀酵母T158c/S14a中L-A病毒-1移码效率改变影响M1病毒的存活,导致K1毒素减少,在低pH的美蓝平板上用杯碟法通过抑菌圈的大小检测酵母K1毒素的嗜杀活性,建立了一个以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型。研究了杯碟法检测酵母毒素嗜杀活性的各种条件。对不同pH和温度下酵母的嗜杀活性进行了研究,确定了模型用于筛选的最适pH范围为4.3~4.7,最适温度范围为20~22℃。运用该模型研究了几种中药对嗜杀活性的抑制作用,发现了金银花和升麻具有一定的抗病毒作用。该模型为抗病毒药物的高通量初筛奠定了基础。     

酿酒酵母对数生长后期代谢重构的全基因组表达谱芯片分析

为了探讨酵母进入对数生长后期以后酒精生产速度降低的原因, 我们利用酵母表达谱芯片技术对酿酒酵母细胞从对数生长中期进入对数生长后期时的全基因组表达谱进行了分析, 发现酵母在对数生长中期的表达谱非常稳定, 而一旦进入对数生长后期, 则出现明显的代谢重构现象。许多氨基酸合成和代谢相关的基因、离子转移以及与能量的生成和储存等功能相关的基因出现了不同程度的上调; 而许多涉及酵母转座和DNA重组的基因则表达下调; 一些中心代谢途径也发生了代谢重构, 包括: 琥珀酸和a-酮戊二酸生成途径基因的一致上调, 都与氨基酸合成和代谢相关基因表达的结果相吻合。结果表明: 由于氨基酸合成的需求量增加, 进入对数生长后期酵母的代谢转向TCA循环和乙醛酸循环, 导致酒精的生产速率降低。     

MXR1基因对毕赤酵母工程茵代谢调控的影响

为了研究毕赤酵母中转录因子Mxrlp在毕赤酵母代谢调控中所起的作用,构建一株以南极假丝酵母脂肪酶B基因(CALB)作为报告基因,MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株.将重组质粒pPIC9K-CALB转化毕赤酵母GS115,利用三丁酸甘油酯平板筛选得到分泌表达CALB的重组茵GS115/pPIC9K-CALB.通过重叠延伸PCR方法获得一段中间含有博来霉素抗性基因sh ble,两翼大约各有1 200 bp与毕赤酵母MXR1基因上下游同源的基因片段,将此片段用氯化锂法转化毕赤酵母细胞GS1 15/pPIC9 K-CALB后,利用博来霉素抗性及CALB酶活力丧失双重筛选的方法得到一株MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株.该菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中不生长,在以乙醇、葡萄糖或者甘油为唯一碳源的培养基中生长缓慢.结果表明转录Mxrlp因子在毕赤酵母中的多条代谢途径中起着关键性的作用,主要涉及甲醇、乙醇、甘油和葡萄糖等代谢途径.     

酿酒酵母对数生长后期代谢重构的全基因组表达谱芯片分析

为了探讨酵母进入对数生长后期以后酒精生产速度降低的原因,我们利用酵母表达谱芯片技术对酿酒酵母细胞从对数生长中期进入对数生长后期时的全基因组表达谱进行了分析,发现酵母在对数生长中期的表达谱非常稳定,而一旦进入对数生长后期.则出现明显的代谢重构现象.许多氨基酸合成和代谢相关的基因、离子转移以及与能量的生成和储存等功能相关的基因出现了不同程度的上调;而许多涉及酵母转座和DNA重组的基因则表达下调;一些中心代谢途径也发生了代谢重构.包括:琥珀酸和α-酮戊二酸生成途径基因的一致上调,都与氨基酸合成和代谢相关基因表达的结果相吻合.结果表明:由于氨基酸合成的需求量增加,进入对数生长后期酵母的代谢转向TCA循环和乙醛酸循环,导致酒精的生产速率降低.