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【目的】研究bagremycin产生菌链霉菌Tü4128中编码酪氨酸酶样铜酶的bagZH基因的功能。【方法】基于同源重组技术敲除bagZH基因,利用HPLC和LC-ESI-MS分析其次级代谢产物谱。在E. coli BL21(DE3)中异源表达BagH并分离纯化,分别以邻氨基酚和3,4-AHBA为底物,利用LC-ESI-MS分析BagH催化产物。【结果】HPLC显示,bagZH基因敲除突变株的bagremycin产量显著降低,回补bagZH基因表达盒后bagremycin产量有所上调。LC-ESI-MS分析bagZH基因敲除突变株的次级代谢产物谱,结果显示,保留时间为3.18 min的新产物分子量为286.32 g/mol,与推测的3,4-AHBA在体内酯化合成的产物分子量吻合。体外生化分析显示,BagH能将邻氨基酚的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)。【结论】本文首次鉴定了bagZH基因编码的酪氨酸酶样铜酶参与bagremycin生物合成。BagH负责将3,4-AHBA的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)避免自身酯化,待与反式对香豆酸衍生物缩合后,再由胞内的还原酶将保护性亚硝基还原为氨基,最终合成bagremycin A和bagremycin B。我们的研究结果为bagremycin作用机制的深入研究以及高产菌株的理性设计与改造提供了基础和参考。 相似文献
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林可链霉菌转化系统的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
利用基因工程技术改良抗生素生产菌有着广阔的应用前景[1]。值得尝试的是将抗生素生物合成基因片段随机或定向组合导入生产菌中,通过同源重组方式提高生物合成途径中限速步骤相关基因的剂量,以达到提高生产菌发酵单位的目的。此战略被作者称为“基因回转化技术”,并... 相似文献
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利用途径工程的基本原理,拟在大肠杆菌核苷酸代谢途径中构建腺苷(AR)转化为腺苷三磷酸(ATP)的新途径,故需使细胞内的腺苷脱氨酶基因(add)缺失。通过构建大肠杆菌MC4100 DNA的基因文库,筛选得到含腺苷脱氨酶基因的DNA片段。构建表达质粒pBD1和pBD2并实现了表达。在此基础上构建了add基因缺失的带卡那霉素抗性基因的线性52kb DNA分子,同时转化JM83、MC4100、BL21(DE3)。经遗传稳定性实验和DNA分子杂交鉴定,确认得到了来自JM83的两株add基因缺陷株J1和J2。再对菌株J1、pUC18/JM83、pBD1/JM83的细胞粗提液做腺苷脱氨酶的酶活鉴定比较,结果表明则没有腺苷脱氨酶活性,pBD1/JM83有比pUC18/JM83强的腺苷脱氨酶活性。 相似文献
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重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。 相似文献
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【背景】大肠杆菌中Small RNA EsrE调控琥珀酸脱氢酶的表达并影响细胞生长,对其调控机制的探究有利于加深EsrE对细胞生长影响的认识。【目的】探究大肠杆菌Small RNA EsrE的转录调控机制。【方法】通过双质粒报告系统筛选转录调控因子,并通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobilityshiftassay,EMSA)和qRT-PCR研究方法验证转录调控因子。【结果】双质粒报告系统证明RNA聚合酶亚基σ~(32) (RpoH)上调P_(esrE),β-羟酰-ACP脱水酶(FabZ)下调PesrE。EMSA结果和体内实验显示RpoH结合P_(esrE)片段,FabZ不结合P_(esrE)片段。【结论】RpoH直接结合启动子序列参与调控,FabZ以其他方式间接参与Small RNA EsrE的转录调控。 相似文献
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迟钝爱德华氏菌EIB202是一类细胞壁结构特殊的革兰氏阴性菌,高质量RNA提取相对较难。为了从转录组水平研究这类致病菌的致病机理,需要摸索有效的RNA提取及RNA样品中痕量基因组DNA去除方法。对常规RNA提取步骤进行改进,增加PBS清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤;另外,利用小体系基因组DNA去除系统,Mg2+与Mn2+协同激活DNase I去除RNA样品中基因组DNA污染。利用优化方法提取的RNA在质量及浓度(1 740 ng/μL)方面均有了显著改善,并建立了一套完全去除RNA样品中痕量基因组DNA污染的程序。 相似文献
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【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。 相似文献