小麦ph1b、ph2a、ph2b突变体与粘果山羊草杂种及其衍生后代的细胞遗传学研究

利用小麦品种“中国春”及其ph1b、ph2a、ph2b基因突变体与粘果山羊草杂交,分析了可交配性方面的差异,观察了F_1花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体配对,就ph1b、ph2a、ph2b 3个基因的作用进行了比较。首次获得了F_1回交种子和自交种子,调查了自交、回交一代植株染色体数目,分析了ph基因对配子育性的影响以及回交结实与染色体配对的关系。本文还分析了F_1自交结实的可能原因。     

海藻糖及其在生物工程方面的应用

自海藻糖发现以来对其化学性质、生理功能、作用机理、代谢途径等已进行了较为深入的研究,其分子生物学的研究也渐渐兴起。研究表明海藻糖能提高生物体对干旱、低温、高温、pH、盐渍等逆境条件下的抗性。离体试验表明海藻糖能保护生物膜、蛋白质的结构并能保持逆境下的酶活性,同时,外源海藻糖同样对生物体有保护作用。由于海藻糖具有这些独特的生物学功能,它已在许多方面得以应用,可作为食品工业的一种添加剂和甜味剂,使干燥食品在得水后保持原有的色、香、味;也可作为医药工业的非特异性生物制品和生化药品保护剂,使其在常温下保存,从而降低运输与储存费用;另外,在农业研究中可利用现代分子生物技术培育表达海藻糖的转基因作物,提高农作物的抗旱、抗冻等抗逆性能。     

Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降

通过RNAi策略转化小麦,以降低小麦种子中直链淀粉的含量。小麦中直链淀粉合成的关键酶是颗粒结合型淀粉合成酶（Granule—bound starch synthase l,GBSSI,即WAXY蛋白）,通过RT—PCR方法从小麦种子中分离出Waxy基因。Southern杂交分析表明,在基因组中存在3个Waxy基因。Northern杂交分析显示出在授粉后的小麦种子中检测到Waxy mRNA。利用RNA沉默策略,将Waxy编码区683bp的正向和反向片段以及150bp内含子,连接于表达载体pCAMBIA3300中玉米ubil启动子下游。以扬麦10号授粉后15d的幼胚为外植体,利用农杆菌介导的方法进行转化。通过PCR、RT-PCR和叶片离体褪绿实验鉴定出4株转基因植株。小麦胚乳I2-KI染色和直链淀粉含量测定表明这4株转基因植株直链淀粉含量明显下降。研究结果表明Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子直链淀粉的含量下降。     

主要农作物转基因研究现状和展望

近15年来,大豆、水稻、玉米、小麦等主要农作物转基因研究取得了较大进展,几乎各种遗传转化方法在这些作物上都取得了成功,尤其是农杆菌介导法,不仅在难转化的双子叶作物大豆上取得了成功,而且在单子叶作物水稻、玉米、小麦上先后取得了突破。同时,将一些与重要性状改良有关的外源基因转入了主要农作物,包括抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品质改良、发育调控、营养吸收等。转基因大豆、玉米、棉花、油菜在生产上得到了大面积种植,产生了极大的经济效益,2004年全球转基因作物的种植面积达到了8100万公顷。本文对大豆、玉米、水稻和小麦等主要农作物转基因研究历史和产业化现状进行了综述,并对主要农作物转基因研究中存在的问题进行了分析。     

小麦体细胞无性系矮秆变异体AS34株高构成和育种潜力探讨

创制和利用矮秆资源对于小麦品种改良具有重要意义。到目前为止,在小麦属中虽然已鉴定了多个矮秆资源,但多数矮秆资源在小麦中的利用价值有限。本研究对利用无性系变异途径获得的小麦矮秆材料AS34及其与模式小麦品种中国春杂交F1、F2材料进行了株高构成和主要农艺性状分析。结果发现,AS34共有4个节间,比其野生型豫麦66少了1个节间,各个节间长度按相似比例缩短,穗下节长度短于第2节长度;F1株高、节间长度指数介于2个亲本之间,节数与AS34相同,穗长、小穗数、穗粒数超过2个亲本;F2株高、穗长、穗粒数、小穗数变异范围广泛,约70%植株株高为60~89 cm,穗长6.0~9.9 cm、穗粒数50~79粒、小穗数20~24个。结果表明,AS34的矮秆变异由多基因控制,表现为数量性状,其矮秆性状对杂交后代穗长、小穗数、穗粒数等主要农艺性状有正向遗传效应,F2选择穗大、粒多、株高适中优良单株的机率较大,具有很好的育种利用价值。     

东方山羊草,属状山羊草中染色体配对控制机制的存在和作用

直接杂交与幼胚培养方法结合获得了小麦与东方山羊草。尾状山羊草属间杂种。Ｆ１杂种细胞学研究表发现,东方山羊草的染色体组显著促进部分同源染色体配对,完全掩盖了小麦ｐｈｌ基因的作用。尾状山羊草的染色体组一定程度抑制部分同源染色配对,尤其强烈抑制小麦ｐｈｌｂ基因的作用。     

农杆菌介导的转化芦荟的研究

芦荟（Aloe）是美容和医疗保健工业的重要植物资源,然而基因工程途径改良芦荟鲜有报道。本实验研究了次氯酸钠、升汞不同浓度和时间对芦荟外植体的灭菌效果,比较了芦荟不同部位（叶片、叶鞘和茎段）的再生能力,利用GUS基因瞬间表达技术（X-Gluc染色）探讨了不同农杆菌对不同芦荟外植体的侵染效果,确定了G418筛选剂在芦荟转化后的最适筛选浓度,摸索了适宜于农杆菌—芦荟共培养用培养基组成和共培养条件,通过转化、筛选和移栽共获得了67棵抗性再生植株,进一步对抗性再生植株进行了PCR、Southern blotting和ELISA检测。结果表明,芦荟外植体灭菌方法为20.0%次氯酸钠溶液浸泡25min,效果优于利用0.1%升汞灭菌处理,茎部切段的再生能力高于叶片切段和叶鞘切段,适宜的共培养条件为芦荟外植体浸泡在含有农杆菌的液体共培养基中半小时后,在无菌滤纸上、24℃、10h光照共培养3天;EHA105农杆菌菌系对芦荟茎部细胞的侵染能力明显强于C58C1,EHA105侵染后GUS基因瞬时表达率达到了80.0%左右,而C58C1侵染后GUS基因瞬时表达率只有30.0%左右。G418用于筛选抗性再生芽和抗性植株的适宜浓度为10.0～25.0mg/L。PCR和Southern blotting检测证实外源基因已成功整合到芦荟基因组中,转化效率为0.9%,单拷贝整合占80.0%,2～3拷贝整合占20.0%,ELISA检测证明外源基因已在转基因芦荟中稳定表达。综上所述,初步建立了农杆菌介导转化芦荟的技术体系,为利用基因工程途径改良芦荟奠定了基础。     

基于地高辛标记对小麦进行Southern杂交分析主要影响因素的优化和验证

以转基因小麦和野生型小麦DNA为材料,对利用地高辛标记对小麦基因组DNA进行Southern杂交分析的影响因素进行了优化研究,包括探针制备与纯化、样品DNA量、酶切体系、真空转印条件、杂交条件、免疫检测方法等。结果表明,对随机引物标记的模板和标记后的探针进行纯化可明显提高探针的标记效率,10μg高质量的DNA样品在80μl的体系中,酶切8～12h可获得良好的效果;真空转膜时使用碱性液比中性液获得的转膜效果更干净;试剂纯度、杂交温度及杂交炉转速等均对杂交效果产生重要影响;配合改进的CSPD涂布方法,使用化学发光检测系统比单纯使用X光片显像更易操作,背景更干净;本研究所优化的地高辛标记的小麦Southern杂交分析显示出较高的灵敏度和信噪比,结果稳定,可克服同位素标记对实验条件、设备及实验人员身体状况等限制,在普通实验室推广应用。     

通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产,农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用,而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的,通过几个中间质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1,其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节,经过在含3～5mg/L glufosinate培养基上多次筛选,获得了一定数量抗性再生植株,然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出51棵T₀代转基因植株,转化频率0.83%～3.16%,二个基因的共转化频率为86.4%。在对T₁代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上,不抗除草剂植株进行PCR、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出41棵无选择标记转基因植株,无标记植株获得率为7.6%。检测结果还表明,T₁代群体中22.7%的株系发生了基因丢失现象,27.3%的株系发生了bar基因沉默现象,目的基因在37.1%的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径     

phlb基因诱导小麦ABD染色体组部分同源染色体配对的研究

通过花药培养首次获得了“中国春”phlb突变体单倍体,同时也获得了“中国春”单倍体。对其细胞学观察表明,前者花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ每个细胞染色体交叉为5.08个,后者为1.30个。证明了phlb基因在单倍体状态下具有强的诱导ABD染色体组部分同源染色体间的配对作用。