鸡氨肽酶N的高效可溶性表达及生物学功能分析

本研究旨为克隆鸡氨肽酶N(chAPN)基因,高效表达可溶性目的蛋白,并测定其生物学功能。应用RT-PCR方法从鸡胚肾细胞中克隆chAPN的基因片段,经测序鉴定后再克隆至原核表达载体pCOLD-TF,构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-chAPN,在大肠杆菌BL21(DE3)中经不同条件诱导表达目的蛋白;利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;Leu-PNA酶促反应和ELISA等方法检测目的蛋白生物学功能。结果显示,重组质粒pCOLD-TF-chAPN在大肠杆菌中以可溶形式高效表达;酶促反应及ELISA结果显示该蛋白具有酶活性,可结合传染性支气管炎病毒(IBV),并表现为剂量依赖性。这为今后研究chAPN的酶活性、作为IBV受体及抗病毒功能奠定了实验基础。     

不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的比较

目的:比较不同致病型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)IBV与鸡氨肽酶N体外结合能力的差异。方法:将已构建的p ET-32a-ch APN转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果。表达的His-ch APN纯化后进行western-blotting验证,应用酶促反应检测其活性。以不同稀释度的纯化ch APN包被ELISA板,加入经过荧光定量PCR方法定量的含有相同数量病毒粒子的三株不同致病型IBV(呼吸型M41、肾型S-03和腺胃型A2-2),测定三株与ch APN的结合能力。结果:p ET-32a-ch APN在受体菌内成功表达,主要以包涵体的形式存在。经纯化复性的重组His-ch APN,Western blotting分析显示其具有良好的抗原性,酶促反应显示该重组重组His-ch APN与天然的具有良好的生物活性。ELISA结果显示ch APN与三株IBV均能结合,其结合能力为A2-2S-03M41,并表现为剂量依赖性。结论:不同致病型IBV与ch APN的体外结合力有一定差异。     

绿头鸭IFN-α的可溶性表达及其活性分析

为了利用原核表达系统研制有生物活性的鸭IFN-α。以pMD18T-Ma IFN-α为模板扩增绿头鸭IFN-α成熟肽基因,将其克隆至原核表达载体pET-32 a中,在大肠杆菌BL21中进行变温诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,并用Western blotting进行验证。Ni2+树脂柱纯化目的蛋白后,测定其生物活性。结果表明,重组pET-32a(+)-Ma IFN-α在大肠杆菌BL21成功表达,主要以可溶性形式存在,Western blotting分析显示目的蛋白具有良好的抗原性。细胞病变抑制法测定重组鸭IFN-α的抗病毒活性约为8×104U/m L;荧光定量PCR方法检测显示表达的重组鸭IFN-α使NDV在DEF上的复制受到了明显的抑制,48 h时间点相对抑制率高达91%。这些都表明表达的重组鸭IFN-α具有良好抗病毒活性。     

圈养狐貉源犬瘟热病毒地方分离株H基因的遗传变异分析

本研究于2004～2006年从人工饲养的发病狐貉中分离到6个CDV分离株,用RT-PCR方法扩增了其H蛋白基因片段,并对其进行了克隆和测序.测序结果表明,6个CDV分离株H基因阅读框全长均为1 824 bp,编码607个氨基酸,未发现碱基的插入和缺失.与Genbank中的34株CDV参考毒株的H基因序列进行比较和分析,现有的CDV毒株可以分为Asia-1、Asia-2、America-1、America-2、Europe和Arctic 6个基因型,本实验中的分离株HL为Arctic基因型,与来自意大利的194/97株、丹麦的Green株同分在一组,其余5株分离株与来自日本的HAMA、UENO、Tanu96等毒株以及来自中国的TN株、GP株(大熊猫株)分在一组同属Asia-1型,表现出一定的地理位置相关性;6个分离株均与Onderstepoor、Convac等疫苗株差异较大、关系较远,提示病毒变异可能是造成目前已免疫动物仍然发生犬瘟热流行的原因之一.