乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白V343A及I341V/V343A联合突变对小鼠脑内神经毒力的影响

为探讨乙脑/寨卡嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)的包膜蛋白V343A突变及I341V/V343A联合突变对小鼠神经毒力的影响，分别构建了V343A和I341V/V343A联合突变的嵌合病毒全长cDNA质粒，经酶切鉴定后，体外转录获得病毒RNA，并电转染入BHK21细胞拯救病毒。利用病毒测序和免疫荧光实验鉴定病毒；蚀斑实验和生长曲线对比突变病毒与亲本株生物学特性差异；动物实验比较神经毒力差异。基因测序与免疫荧光等证明突变病毒JE/ZIKV(V343A)和JE/ZIKV(I341V/V343A)拯救成功。突变病毒JE/ZIKV(V343A)和JE/ZIKV(I341V/V343A)的蚀斑直径分别为（1.09±0.15） mm和（1.15±0.29） mm，小于亲本株JE/ZIKV(MR766)蚀斑直径（2.09±0.36） mm（P<0.001）；生长曲线显示两突变病毒增殖速度均快于亲本株，且JE/ZIKV(I341V/V343A)快于JE/ZIKV(V343A)；动物实验结果显示，JE/ZIKV(V343A)的LD50为5.62 pfu/0.03 mL，JE/ZIKV(I341V/V343A)的LD50为34.84 pfu/0.03 mL，均高于亲本株（LD50=2.21 pfu/0.03 mL）。研究结果表明，寨卡病毒E蛋白V343A突变使嵌合病毒小鼠脑内神经毒力减弱，I341V/V343A联合突变使病毒毒力进一步减弱，表明E蛋白的341和343位氨基酸残基参与了嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力的调控。     

乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白T120A位点突变对小鼠脑内神经毒力的影响

为探索包膜蛋白T120A突变对乙脑/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV小鼠脑内神经毒力的影响,应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含T120A突变的乙脑/寨卡嵌合病毒全长cDNA质粒,经酶切、测序鉴定后,以其为模板体外转录制备RNA,电转染导入BHK21细胞,收获培养液上清获得突变病毒株JEV/ZIKV (T120A)。分别用JEV/ZIKV和JEV/ZIKV (T120A)感染BHK21细胞,绘制病毒增殖曲线,比较蚀斑大小;脑内接种昆明鼠,比较病毒小鼠脑内神经毒力差异。突变病毒感染性克隆经酶切鉴定表明成功构建,增殖曲线发现:突变病毒高峰滴度为5.59 log_(10)pfu/mL,低于JEV/ZIKV的峰值(6.8 log_(10)pfu/mL),JEV/ZIKV (T120A)的小鼠脑内神经毒力LD_(50)为1.38 PFU(0.03 mL),JEV/ZIKV病毒LD_(50)为2.21 PFU(0.03 mL)。研究表明寨卡病毒包膜蛋白T120A突变降低了乙脑/寨卡嵌合病毒的复制能力,但却轻微增强了病毒小鼠脑内神经毒力。     

乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠毒力的影响

为探究乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠神经毒力和神经侵袭力的影响，以乙脑病毒疫苗株SA14-14-2为模板，对NS2A基因进行A66G定点突变，并构建全长感染性克隆。体外转录后，将病毒RNA导入BHK21细胞，获得突变病毒SA14-14-2（A66G）。同样以乙脑病毒野毒株SA14为模板，采用相同方法构建并获得突变病毒SA14（G66A）。经测序和间接免疫荧光鉴定，证明突变病毒构建成功。Western blot检测发现疫苗株SA14-14-2和SA14(G66A)不表达NS1′蛋白，而野毒株SA14和SA14-14-2（A66G）能表达NS1′蛋白。生长曲线显示突变病毒的生长特性无明显改变。蚀斑实验发现SA14(G66A)的蚀斑较SA14更小，SA14-14-2(A66G)的蚀斑较SA14-14-2更大。细胞增殖活性实验显示NS1′蛋白表达对BHK21细胞的增殖有明显抑制作用 (P＜0.01)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2（A66G）对1周龄小鼠脑内接种的LD50分别为297.9 PFU(0.02 mL)和143.4 PFU(0.02 mL)，野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠脑内接种的LD50分别为0.8 PFU(0.03 mL)和2.3 PFU(0.03 mL)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2(A66G)对2周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为＞5.65×10⁶ PFU(0.5 mL)和＞1.46×10⁶ PFU(0.5 mL)。野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为1.3×10³ PFU (0.5 mL)和1.2×10⁴ PFU(0.5 mL)。结果表明，乙脑病毒NS2A中第66位碱基是影响NS1′蛋白表达与否的关键位点，且NS1′蛋白表达能提高病毒对小鼠的神经毒力与神经侵袭力，其中对侵袭力的影响更为显著。     

重组人硫氧还蛋白工程菌生物学特性稳定性的检测

[目的]观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性.[方法]工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性.[结果]各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段;各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20％左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异.[结论]该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种.