贵州烟草根围AM真菌多样性的初步研究

从贵州省内烟区不同土壤生态环境下采集烟草根际土样,湿筛离心法分离丛枝菌根(AM)真菌孢子,鉴定出烟草AM真菌4属20种,其中球囊霉属9种,无梗囊霉属7种,巨孢囊霉属3种,盾巨孢囊霉属1种。从土壤样品DNA中扩增AM真菌特异性片段并采用DGGE技术对AM真菌多样性进行分析。测序结果显示烟草根际土壤中菌根真菌主要菌群为球囊霉属,与湿筛离心法的鉴定结果一致。为进一步研究贵州地区AM真菌多样性以及开发应用提供了依据。     

赤星病胁迫对不同抗性烟草品种光合作用和叶绿素荧光特性的影响

以不同烟草赤星病抗性品种JYH(抗病品种)和CBH(感病品种)为材料,在盆栽试验条件下,调查不同烟草赤星病胁迫程度(轻度胁迫、中度胁迫和重度胁迫)对光合色素含量、光合作用参数和叶绿素荧光动力学特征的影响。结果显示:1)烟草赤星病胁迫导致2个品种的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均呈下降趋势,且JYH的降幅小于CBH。2)除JYH的净光合速率在轻度胁迫下有所增加外,JYH、CBH的净光合速率、气孔导度因烟草赤星病胁迫而降低。2个品种的胞间CO2浓度、气孔限制值变化具有明显差异,烟草赤星病胁迫导致CBH的胞间CO2浓度上升,气孔限制值则明显下降,这与JYH在重度胁迫下的变化趋势一致。而JYH的胞间CO2浓度在轻度、中度胁迫降低,气孔限制值则呈上升趋势。3)烟草赤星病胁迫下,2个品种的初始荧光(F0)、非光化学猝灭系数(NPQ)均有所增加。重度胁迫下,JYH、CBH的F0分别比对照增加16.5%、34.48%,NPQ分别上升95.54%、137.45%,差异均达到显著水平。而各品种的最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/F0)、光化学淬灭系数(qp)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)在烟草赤星病胁迫下均呈下降趋势,降幅表现为JYHCBH。研究结果表明,JYH的光合色素、光合作用和叶绿素荧光特性受烟草赤星病胁迫影响小于CBH,维持较高的光合性能是对烟草赤星病具有较强抗性的生理基础。     

烟草蛋白酶抑制剂基因的电子克隆及生物信息学分析

蛋白酶抑制剂可以增强植物对病虫害的抵抗能力,为了深入研究蛋白酶抑制剂在烟草中的作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了烟草品种K326中的4种蛋白酶抑制剂cDNA序列(NtPI-1、NtPI-2、NtPI-3和NtPI-4)并对其进行了序列分析.它们编码的氨基酸序列都具有典型的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ家族功能结构域,属于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ家族成员.序列分析表明,4种蛋白酶抑制剂基因cDNA序列均具有完整的开放读码框,依次编码128、95、94和72个氨基酸残基,它们的氨基酸序列一致性在31％-38％之间.系统树分析表明,烟草品种K326中的4种蛋白酶抑制剂分散在进化树的不同位置,形成不同亚群.     

花烟草NaERF1基因的克隆及在非生物胁迫下的表达模式分析

AP2/ERF类转录因子,是植物所特有的最大的一类转录因子家族,在植物的生长发育过程中,扮演着重要的角色。探究花烟草ERF转录因子的生理功能,为花烟草抵御逆境的分子机制研究提供借鉴。采用同源克隆的方法进行基因克隆。通过对花烟草进行非生物胁迫,运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。从花烟草(Nicotiana alata)中克隆了一个属于ERF家族的基因NaERF1。该基因的开放阅读框全长为819 bp,编码了272个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为30.7 kD,等电点为6.07;具有AP2/ERF类转录因子家族典型的保守结构域;该基因主要定位于细胞质内,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NaERF1基因与茄科植物的ERF同源性较高,并且与普通烟草的ERF亲缘关系最近。NaERF1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。同时,在高盐、干旱、低温、ABA、低钾及H2O2等非生物胁迫下,NaERF1的表达呈现5种模式。其中,对低钾及ABA胁迫的响应强烈。NaERF1基因属于AP2/ERF类转录因子,可能广泛参与了花烟草包括非生物胁迫响应在内的众多生理过程。     

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。     

烟草种质基因分型核心SNP标记的开发

基于KASP(kompetitive allele specific PCR)技术平台，开发并验证可用于烟草核心种质基因分型的SNP(single nucleotide polymorphism)标记和对应检测引物，为烟草种质基因型鉴定评价、遗传多样性分析、核心种质筛选等提供技术和数据支持。利用Python和Perl脚本程序对覆盖烟草全基因组的1 179 154个SNP位点进行KASP引物设计和筛选，并通过试验验证其准确度和可用性。结果共有217 621个SNP位点完成了对应KASP引物设计，选择1 378个SNP位点进行试验验证，明确了732个可作为SNP标记，并确定48个SNP标记作为烟草种质资源基因分型的核心标记。这48个核心标记在烟草24条染色体上平均分布，平均PIC为0.36，平均MAF为0.39。利用确定的48个核心SNP标记，可以将各供试种质特别是将当前主栽烟草品种基因型进行区分，且标记具有极高的可靠性。