青岛地区COVID19流行病学特征分析

目的分析青岛地区新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的流行病学特征。方法纳入青岛市自2020年1月21日至3月3日所有COVID-19确诊病例(n=60),收集患者基本信息和流行病学资料,分析易感人群、传播模式、基本繁殖数、疫情进展及其与防控措施的相关性。结果 60例确诊患者包括27例输入性病例和33例本地感染病例。本地感染者以女性为主,占69.7%,显著高于输入性病例(37.0%)(χ~2=6.400,P=0.011)。本地共发生三代传播,发病例数逐代减少。青岛地区总病例R0值为1.49。本地一代、二代和三代的R0值分别为1.38、1.53、1.56。传播模式由家庭聚集性向密切接触转换。结论青岛地区本地传播病例女性易感,日新增病例总体呈波浪式下降趋势,目前疫情已基本得到控制,应进一步做好分区分级精准防控,加强对外来人员的隔离观察,防止出现疫情反弹。     

人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究

3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF 3a 和ORF 7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。     

外周血NETs、TP53、STAT3表达与弥漫性大B细胞淋巴瘤临床病理及预后的关系分析

摘要 目的：探究外周血中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）、TP53、信号转导与转录因子3（STAT3）表达与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）临床病理及预后的关系。方法：选取2020年3月-2021年12月收治的71例DLBCL患者作为研究对象,抽取患者外周静脉血,采用R-CHOP方案进行治疗,记录患者外周血NETs、TP53、STAT3表达情况并分析DLBCL患者外周血NETs、TP53、STAT3表达与其临床病理及预后的关系。结果：髓细胞组织增生蛋白（MYC）阳性在TP53阳性中的占比显著高于TP53阴性,差异有统计学意义（x²=28.844,P＜0.001）;Hans分型生发中心B细胞（GCB）在STAT3阳性中的占比显著高于STAT3阴性（x²=4.331,P=0.037）,其余差异无统计学意义（P>0.05）;随访截止至2022年6月,随访时长8~28个月,71例患者中共53例缓解DLBCL患者,其余18例为R/R DLBCL患者;NETs阳性、TP53阳性、STAT3阳性患者无进展生存期（PFS）显著低于NETs阴性、TP53阴性、STAT3阴性患者,差异有统计学意义（P<0.05）且NETs阳性、TP53阳性、STAT3阳性患者存活率均低于NETs阴性、TP53阴性、STAT3阴性患者（P<0.05）;单因素分析结果显示Ann Arbor分期、NETs、TP53、STAT3为DLBCL患者的影响因素（P<0.05）;以患者预后情况（R/R DLBCL=1,缓解DLBCL=0）为因变量,将Ann Arbor分期、NETs、TP53、STAT3单因素分析有统计学意义的因素纳入COX回归模型中,结果显示：NETs、TP53、STAT3为DLBCL患者预后的危险因素（P<0.05）。结论：TP53、STAT3表达与DLBCL临床病理存在一定相关性,临床应对DLBCL患者TP53、STAT3表达情况引起重视;NETs、TP53、STAT3表达为DLBCL预后的危险因素,可作为DLBCL患者不良预后的预测指标。     

通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中,哺乳动物细胞生长活力差,且容易发生细胞凋亡,因而难以大规模培养。为解决此问题,应用双顺反子表达载体在CHO-dhfr^-细胞中同时表达Igf-1／Bcl-2或Bcl-2／CyclinE基因组合,通过Bcl-2使细胞获得抗凋亡能力;通过1gf-1或CyclinE促进细胞生长分裂,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO-dhfr^-细胞,应用Western blot从G418抗性克隆中分别筛选到Bcl-2高表达克隆若干个,对其中表达Bcl-2最高的CHO-IB3和CHO-Bcl做进一步Western blot和流式细胞分析,确认此两个细胞株分别高表达Igf-1／Bcl-2和Bcl-2／CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡,并以流式细胞术和DNA Ladder法检测细胞凋亡,证明CHO-IB3和CHO一BCl均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明,CHO-IB3和CHO-BCl在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO-dhfr^-对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长,适于作为生物工程宿主细胞。     

促进CHO细胞生长及其产物hNGF表达的培养条件的初步研究

以稳定表达人神经生长因子（hNGF）的重组工程CHO细胞株为对象,采用无血清流加悬浮培养（Fed batch culture）方式,考察使用基础培养基(无特殊添加物),分别添加丁酸钠、DMSO、KH2PO4的培养基及不同培养温度（32℃和37℃）对细胞生长和重组蛋白表达的影响。每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、重组蛋白浓度。结果表明细胞培养温度由37℃下降至32℃,细胞生长周期明显延长,重组蛋白产量增加。5mmol/L丁酸钠和2% DMSO的加入虽然提高了重组蛋白的表达量,但严重抑制细胞生长。最大的蛋白比生成速率（qNGF）出现在37℃培养且添加2% DMSO的培养条件下,而最高蛋白表达量则出现于32℃培养添加3.65mmol/L KH2PO4的培养条件下。研究表明,将培养温度设为32℃,在基础培养基中添加3.65mmol/L KH2PO4或1% DMSO是提高hNGF表达水平的有效方法。     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

镇海水库拟柱孢藻的分离鉴定和氮磷对其生长的影响

以分离自广东省镇海水库的拟柱孢藻N8为对象,探究其在不同磷浓度及氮磷浓度组合下的生长情况。结果表明,拟柱孢藻N8对磷的适应范围很宽,在0.02—5.12 mg/L磷浓度下均能生长,最适生长磷浓度范围为0.16—5.12 mg/L,磷浓度的升高能显著延长拟柱孢藻的对数生长期和提高生物量。动力学分析表明,拟柱孢藻N8有较低的KSP值,对磷元素的亲和性较高,在磷营养贫乏的环境下更容易形成优势。在氮磷组合实验中,低氮(0.5 mg/L)显著抑制拟柱孢藻的生长,且这种生长抑制不受磷浓度的影响;而在低磷(0.04 mg/L)条件下,水体中氮浓度的增加会显著促进拟柱孢藻的生长,拟柱孢藻在高氮中磷和高氮高磷下的生长显著优于其他氮磷组合条件。研究表明,广东省水库拟柱孢藻的生长受磷的限制较弱,氮是其生长的决定因子。     

粪便分离大肠埃希菌CRISPR系统在耐药及毒力中的作用

目的探索粪便分离大肠埃希菌成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)在耐药及毒力中的作用。方法收集某院2018年8-12月分离自慢性腹泻患者及健康体检者粪便样本的大肠埃希菌。采用纸片扩散法检测其药物敏感性,PCR法检测并比较分析腹泻患者及健康体检者粪便样本分离大肠埃希菌的系统发育群、耐药基因及CRISPR系统。结果共收集到142株大肠埃希菌,源于63例慢性腹泻患者(疾病组)和79例健康体检者(健康组)。药敏结果显示,氨苄西林耐药率为48.0%,其余抗菌药物敏感率为73.1%～100.0%。63株源于慢性腹泻患者粪便样本分离大肠埃希菌中CRISPR系统的检出率显著低于79株源于健康体检者(3.2%vs 46.8%,χ~2=33.538,P0.001)。在被检测的耐药基因中,63株疾病组中11株阳性(7株bla_(CTX-M-1)组、3株bla_(CTX-M-9)组和1株mcr-1),79株健康组中4株bla_(CTX-M-1)组,未携带耐药基因菌株中CRISPR系统的检出率显著高于携带耐药基因菌株(0.0%vs 29.9%,P=0.011)。43株高毒力菌株(B2群和D群)中CRISPR系统的检出率显著高于99株低毒力菌株(A群和B1群)(44.2%vs 20.2%,χ~2=8.656,P=0.003)。结论粪便分离大肠埃希菌对常用抗菌药物仍保持较高敏感性。CRISPR系统可能在粪便分离大肠埃希菌毒力及耐药基因的传播方面发挥重要作用。     

mCIM试验检测临床产碳青霉烯酶革兰阴性杆菌的应用价值

目的评估改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)在检测临床产碳青霉烯酶革兰阴性杆菌中的应用价值。方法采用mCIM、改良Hodge(MHT)及Carba NP试验分别检测106株碳青霉烯酶基因阳性的革兰阴性杆菌(36株肠杆菌科细菌、26株铜绿假单胞菌及44株鲍曼不动杆菌),并比较差异。同时,收集湘雅医院2016年1月-12月临床分离的非重复性耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌106株,同期随机选取100株分离的碳青霉烯类敏感菌株作为对照组,mCIM试验检测碳青霉烯酶,PCR检测碳青霉烯酶基因,分析其敏感性及特异性。结果 (1)106株碳青霉烯酶基因阳性菌株,mCIM试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为88.9%(32/36),铜绿假单胞菌均为阴性。MHT试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为77.8%(28/36),铜绿假单胞菌的敏感性、特异性为69.2%(18/26)。Carba NP试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为97.2%(35/36),铜绿假单胞菌的敏感性、特异性为57.7%(15/26)。鲍曼不动杆菌3种方法均为阴性。肠杆菌科细菌中,MHT与Carba NP试验差异有统计学意义(χ~2=6.222,P=0.028),MHT与mCIM试验差异无统计学意义(χ~2=1.600,P=0.343),Carba NP与mCIM试验差异无统计学意义(χ~2=1.934,P=0.357);铜绿假单胞菌中,MHT与Carba NP试验阳性,二者差异无统计学意义(χ~2=0.746,P=0.565)。(2)144株临床分离肺炎克雷伯菌(碳青霉烯类耐药及敏感菌株分别为44株、100株),采用美罗培南和亚胺培南分别做mCIM试验,其敏感性和特异性均为100%,且与PCR的结果一致。结论 mCIM试验在肠杆菌科细菌中敏感性高、特异性强,操作简单,结果易于判断,具有良好的临床应用价值。     

一种有效分离沙冬青线粒体基因组DNA的方法

线粒体作为重要的细胞器,在植物进化适应过程中起着不可忽视的作用。抗旱耐寒常绿阔叶灌木沙冬青主要分布在我国西北荒漠地区,是第三纪孑遗植物,研究该植物线粒体基因组与长期进化适应的关系具有重要意义。然而,用常规的方法难以分离纯化获得沙冬青线粒体基因组DNA,限制了沙冬青线粒体功能基因组研究。该研究利用不连续蔗糖梯度密度离心和DNase I消化技术,成功获得了高纯度沙冬青线粒体DNA,该线粒体DNA的纯度和完整性满足建库的要求,为沙冬青线粒体基因组研究提供了技术支持,对其他植物线粒体基因组学研究也具有参考价值。