MehpH的生化与结构特性（英文）

【目的】本研究旨在系统探究环境因素对邻苯二甲酸单乙基己基酯水解酶(monoethylhexyl phthalate hydrolase,MehpH)活性的影响,模拟该酶的3D结构并分析活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用。【方法】根据标准的酶学实验验证了环境因素对酶活性的影响。该酶的基本结构分析由DNAMAN(2.1)分析所得,同时利用SWISS-MODEL对其3D模型进行预测,并通过PyMOL软件对相关结果作了可视化处理。Autodock工具,Swiss-Pdb以及Py MOL均用以酶与邻苯二甲酸单乙基己基酯(monoethylhexyl phthalate,MEHP)的相互作用分析。【结果】该酶的初级结构与已报道Gordonia sp.P8219菌株中的酯类水解酶相似,该酶的最适温度与p H(分别为40°C和8.0)和菌株P8219有所不同;该酶在有机溶剂、洗涤剂和金属离子环境中表现出良好的稳定性;然而,其酶活受2 mol/L的Ni~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)离子,1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.5 mol/L的对氧磷,1 mol/L苯基醚(PGO),2 mol/L焦碳酸二乙酯(DEPC)和5 mol/L的毒扁豆碱所抑制。丝氨酸水解酶中高度保守五肽基序GXSXG与催化三联体HSD结构均存在于该酶的编码序列中。根据分子对接结果,Thr152与Ser230在水解酶与其模板之间也显得更为保守,且与MEHP联系较为紧密(分别为5.8?和3.6?),可能起着重要的催化作用。而MEHP与催化氨基酸残基Ser125、His291、Asp259并不十分靠近。【结论】YC-RL2中MehpH在有机溶剂、洗涤剂以及金属离子环境中具有稳定的生物活性,表明其具有良好的应用潜力。酶的结构及活性中心得到了初步的分析,对于催化机理及酶改造研究具有重要意义。     

MehpH的生化与结构特性

[目的]本研究旨在系统探究环境因素对邻苯二甲酸单乙基己基酯水解酶（monoethylhexyl phthalate hydrolase,MehpH）活性的影响,模拟该酶的3D结构并分析活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用。[方法]根据标准的酶学实验验证了环境因素对酶活性的影响。该酶的基本结构分析由DNAMAN （2.1）分析所得,同时利用SWISS-MODEL对其3D模型进行预测,并通过PyMOL软件对相关结果作了可视化处理。Autodock工具,Swiss-Pdb以及PyMOL均用以酶与邻苯二甲酸单乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate,MEHP）的相互作用分析。[结果]该酶的初级结构与已报道Gordonia sp. P8219菌株中的酯类水解酶相似,该酶的最适温度与pH （分别为40℃和8.0）和菌株P8219有所不同;该酶在有机溶剂、洗涤剂和金属离子环境中表现出良好的稳定性;然而,其酶活受2 mol/L的Ni²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺和Zn²⁺离子,1 mol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）,0.5 mol/L的对氧磷,1 mol/L苯基醚（PGO）,2 mol/L焦碳酸二乙酯（DEPC）和5 mol/L的毒扁豆碱所抑制。丝氨酸水解酶中高度保守五肽基序GXSXG与催化三联体HSD结构均存在于该酶的编码序列中。根据分子对接结果,Thr152与Ser230在水解酶与其模板之间也显得更为保守,且与MEHP联系较为紧密（分别为5.8 Å和3.6 Å）,可能起着重要的催化作用。而MEHP与催化氨基酸残基Ser125、His291、Asp259并不十分靠近。[结论]YC-RL2中MehpH在有机溶剂、洗涤剂以及金属离子环境中具有稳定的生物活性,表明其具有良好的应用潜力。酶的结构及活性中心得到了初步的分析,对于催化机理及酶改造研究具有重要意义。     

联苯利用节杆菌YC-RL1中2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC功能验证

【目的】通过节杆菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1对多氯联苯降解过程中关键基因bph C的克隆与原核表达,鉴定其编码的2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶Bph C的酶活特性与功能。【方法】以菌株YC-RL1全基因组为模板进行PCR扩增获得bph C基因,将该基因转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞后进行原核表达;利用镍柱亲和层析法对Bph C酶进行纯化并分别测定该酶在不同条件下对底物2,3-DHBP的催化特性,确定其最适反应pH、温度及不同金属离子对酶活特性的影响;进一步根据米氏方程对该酶的动力学参数进行测定与分析。【结果】通过PCR扩增获得了bphC基因,其大小为930 bp;对该基因进行原核表达,所得重组蛋白BphC携带有6个组氨酸标签,经纯化后体外仍具有活性,该酶作用于2,3-DHBP时的最适pH与温度分别为pH 7.4和30°C,且在最适条件下,Fe~(2+)、Cu~(2+)及Cd~(2+)等金属离子可明显促进其酶活作用,但多数金属离子对该酶有不同程度的抑制作用;该酶在与底物2,3-DHBP作用过程中,酶促动力学常数分别为K_m:8.67 mmol/L,V_(max):27.32μmol/s,k_(cat):15.55 s~(–1),k_(cat)/K_m:1.79 L/(mmol·s),其催化效率同有关报道中同类酶的动力学特性比较均有所提高。【结论】菌株YC-RL中的bphC基因对于多氯联苯的生物降解具有至关重要的作用,其编码的BphC是重要的芳香环裂解酶,该酶对其底物具有较高的亲和性,可在体外环境中发挥高效的酶促作用,具有良好的应用价值。