铜绿假单胞菌色素代谢相关基因的研究

首次应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌色素合成与调控的机制。通过一系列的表型筛选,得到8株色素合成能力改变的突变子。经基因克隆、核苷酸测序研究,证明转座子分别插入到hmgA、ptsP、sucC、phzS、phzF1五个基因中。hmgA基因转座失活导致酪氨酸分解代谢中间产物尿黑酸的积累,后四种情况转座突变显著地影响了铜绿假单胞菌最重要的色素绿脓素（pyocyanin）的合成,其中PhzS和phzF1是绿脓素合成过程中的结构基因,ptsP基因是1个磷酸转移酶系统的重要组分,sucC基因的产物是三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A合成酶,对后两个基因在色素合成的调控方面可能起到重要作用的报道尚属首例。     

铜绿假单胞菌泳动能力相关新基因的筛选及鉴定

从Mu转座突变子文库中经过表型筛选,得到12株泳动(Swimming motility)能力缺陷的突变子,经Mu转座子插入位点的确认、基因克隆及测序分析发现其中10个突变子中Mu转座子分别插入到10个不同的与鞭毛运动和功能相关的基因中,2个突变子中Mu转座子插入到功能未知的新基因(PA2950和PA5022)中,电镜观察结果表明这2个突变株均具有完整的鞭毛,初步推测这2个基因可能是参与鞭毛泳动的能量代谢、趋化作用或信息传递的新基因。     

铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响

[目的]检测铜绿假单胞菌基因pfm对三型分泌系统效应蛋白的影响.[方法]构建pfm基因互补菌株pfmC.提取野生株PAO1、敲除株Δpfm和互补株pfmC的RNA,利用Real-time PCR从转录水平检测效应蛋白ExoS、ExoT和ExoY转录水平的变化.以ExoS为代表,检测细胞内和分泌到细胞外效应蛋白的含量.收集铜绿假单胞菌PAO1、Δpfm和pfmC菌体内和分泌到细胞外的总蛋白,利用ExoS多克隆抗体进行Western杂交,特异检测ExoS的蛋白水平.[结果]与野生型相比,Δpfm中exoS、exoT和exoY转录水平明显降低,而pfmC中这3个蛋白的转录水平得到回补.Δpfm菌体内和分泌到细胞外的ExoS量均明显低于野生株PAO1,pfmC细胞内和细胞外分泌的ExoS蛋白量均得到恢复.[结论]铜绿假单胞菌基因pfm会影响三型分泌系统效应蛋白的水平.     

线粒体遗传工程及其意义

自线粒体被发现以来,对线粒体的起源、结构和功能,线粒体与核的相互作用及线粒体基因表达规律开展了一系列的研究.线粒体是半自主性细胞器,其遗传转化有着核基因转化不可比拟的优势,近年来国际上的相关研究非常活跃并日益得到关注.综述了线粒体基因组的特点、线粒体遗传转化方式、线粒体基因表达中的RNA编辑现象与规律、线粒体转化的筛选标记及线粒体遗传工程的应用等方面的最新研究进展.     

双孢蘑菇酪氨酸酶基因在酿酒酵母中的异源表达及其酶学特性

【目的】在酿酒酵母中异源表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶基因PPO2,并研究酪氨酸酶在酿酒酵母胞内及胞外的酶学特性。【方法】提取双孢蘑菇总RNA,通过RT-PCR克隆酪氨酸酶基因PPO2,构建表达载体pSP-G1-PPO2,并转化至酿酒酵母进行表达,采用镍亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。【结果】在酿酒酵母中正确表达了大小为65 kDa的酪氨酸酶蛋白。重组酶能催化底物酪氨酸产生黑色素。体外活性测定表明,酪氨酸酶催化最适温度为45°C,以酪氨酸和多巴为底物时最适pH分别为7.0和8.0。在酿酒酵母中测得底物酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时,黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性。【结论】来源于双孢蘑菇的酪氨酸酶基因PPO2在酿酒酵母中成功表达,重组酶具有良好的酶学特性。利用酪氨酸酶产物黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性这一特性,可将其作为细胞酪氨酸产量的传感器,为高通量筛选酪氨酸高产菌株提供了思路。     

Cdk5/p35激酶与肌动蛋白细胞骨架结合关系的鉴定

Cdk5,一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其活性只有通过结合其神经特异性调节亚基才能被激活.p35是Cdk5的两个主要调节亚基之一.尽管Cdk5/p35激酶可以调控神经细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态变化,但直到目前为止Cdk5/p35激酶与肌动蛋白细胞骨架的结合关系仍不是很清楚.现利用几种不同的方法对两者的结合关系进行了初步鉴定.目前的试验结果表明在鼠脑组织中肌动蛋白细胞骨架是Cdk5/p35超大蛋白复合体的一个组分,p35可以直接结合纤维状肌动蛋白,这说明在鼠脑组织或神经细胞中Cdk5很有可能是通过p35结合到肌动蛋白细胞骨架上并进一步调控肌动蛋白细胞骨架的动态活动的.     

植物细胞器间遗传信息转移

真核生物细胞质中有多种执行特定功能的细胞器, 其中线粒体和质体含有独立的基因组, 但细胞器的遗传信息储量有限, 其多数结构和功能蛋白质仍然由核基因组编码.来自植物的相关研究表明, 细胞核与细胞器间不仅在功能上相互依存, 而且遗传信息分子能跨越生物膜屏障, 在细胞核与细胞器间及不同的细胞器间进行传递, 并由此可以引起部分遗传信息在细胞内定位及基因表达等方面的相应改变.细胞器间遗传信息转移机制的研究将为深入认识核质相互作用及真核生物的进化提供重要的线索.     

真菌疏水蛋白HGFI自组装分子机制和材料表面修饰功能的研究

真菌疏水蛋白是高等丝状真菌在特定生理时期分泌的一类小分子量、两亲性蛋白质,其可以在两相界面处通过自我装配形成纳米级蛋白膜,改变介质表面的亲水性和疏水性.疏水蛋白独特的自组装性质使其在不同的领域均具有应用潜力,如材料表面修饰、乳化、蛋白纯化、药物传送和生物传感器制作等.本文主要介绍了真菌疏水蛋白的国内外研究进展,并针对本课题组发现的灰树花真菌疏水蛋白,介绍其自组装分子机制、在材料表面修饰以及药物缓/控释等方面的应用研究.     

铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因的研究

应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)蹭行运动 (Twitchingmotility)的相关基因。通过转座突变、表型筛选 ,得到 8个Twitchingmotility缺陷或减弱的突变子。经过基因克隆、核苷酸测序研究 ,鉴定转座子插入到基因组中的位置。结果表明 ,在其中 4个突变子中 ,转座子分别插入到与IV型菌毛生物合成和功能相关的 3个已知基因中 (其中有两个突变子转座子插入到同一基因的不同位置 ) ,它们是pilV ,pilQ ,algR。另外 4个突变子中 ,有 3个是转座子分别插入到基因pilL基因的前端 ,中部和后端 ,均引起Twitchingmotility功能缺失。另一个突变子中 ,转座子插入到基因PA1 82 1中 ,引起Twitchingmotility功能减弱。PilL和PA1 82 1的编码产物均属于 3 类蛋白质 ,它们的功能是根据其保守的氨基酸基序或基因序列与已知功能基因的相似性推测得出的。但缺乏详细的试验证据。研究结果为pilL控制Twichingmotility提供了有力的证据。并证实基因PA1 82 1与Twitchingmotility有关。将Mu转座重组技术应用到假单胞菌的研究中 ,国内外均未见报道。由于该技术具有随机单点插入的优点 ,克服了传统转座子能在染色体上迁移的缺点。保证了表型的改变与转座子插入位点的基因突变的一一对应关系。为进一步研究铜绿假     

CRISPR-Cas9系统与mazF介导的大片段删减法在酿酒酵母染色体大片段删减中的比较

【目的】比较CRISPR-Cas9系统与maz F法这两种酿酒酵母染色体大片段删减方法。【方法】分别用上述两种方法删减了酿酒酵母长度为26.5 kb的染色体大片段YKL072W-YKL061W,并比较了两种方法的转化效率、敲除成功率。【结果】利用CRISPR-Cas9系统平均得到5个转化子,但正确率为100%;maz F法得到约100个转化子,正确率略低于前者,为93%。【结论】两种方法均能高效删减酿酒酵母染色体大片段,CRISPR-Cas9系统正确率较高,操作简便省时;maz F法相对稳定,对目的基因无PAM位点要求。