创伤弧菌TF3全基因组包含的CRISPR-Cas系统及MGIVvuTF3基因岛分析

【目的】分析创伤弧菌(Vibrio vulnificus)全基因组框架序列,挖掘感兴趣的遗传位点,探索其是否具有CRISPR系统及其特征。【方法】在病虾体内分离获得了一株创伤弧菌TF3,通过Illumina Miseq测序得到基因组框架序列。经注释分析发现其基因组中存在一个CRISPR-Cas系统,命名为CRISPR-CasTF3,进一步分析发现CRISPR-CasTF3位于一个基因岛上,将该基因岛命名为MGIVvu TF3。对CRISPR-CasTF3及MGIVvu TF3的特征和来源进行了分析。【结果】CRISPR-CasTF3属于与大肠杆菌类似的Ι-E型CRISPR-Cas系统,CRISPR-CasTF3包括8个cas基因,其排列为cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2;具有50个重复序列,每二个重复序列间为一个Spacer序列。MGIVvu TF3具有att L和att R序列,含有位点特异性整合、剪切、转移相关的基因。MGIVvu TF3与霍乱弧菌O395基因组中的一个基因岛MGIVch0395具较高相似性,二者最显著的差别在于Spacer序列完全不同,以及各有几个非保守的预测基因。【结论】MGIVvu TF3及CRISPR-CasTF3极有可能通过基因水平转移获得,并且CRISPR-CasTF3系统可以借助MGIVvu TF3实现水平转移。     

环介导等温扩增技术快速检测施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)

【背景】近年来,珊瑚白化事件频有发生,面临着严重衰退。由气候变化引起的珊瑚病原菌快速增殖是导致珊瑚白化的主要因素之一。施罗氏弧菌是枇杷珊瑚的致病菌,能侵入珊瑚虫体内而使珊瑚白化死亡。【目的】优化并建立一种钙黄绿素显色法快速检测珊瑚致病菌施罗氏弧菌的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplificaiton,LAMP)检测技术。【方法】以枇杷珊瑚致病菌施罗氏弧菌为研究对象,针对施罗氏弧菌的rpoD (RNA polymerase subunit D)基因设计6条特异性扩增引物,建立LAMP检测体系并检测其特异性和灵敏度,同时对LAMP法、常规PCR和荧光定量PCR3种检测方法进行比较分析。【结果】供检测的10个样品菌株中,施罗氏弧菌反应结果为阳性,呈亮绿色,其他9株包括阴性对照(灭菌水为模板)反应结果为阴性,呈浅橙黄色;同时,所建立的钙黄绿素-LAMP方法最低检测限度为3.641×10~3 cps/mL,具有与荧光定量PCR等同的灵敏度和准确性,是常规PCR最低检测限度的0.1%;此外,通过模拟野外海水样品检测发现,钙黄绿素-LAMP方法对海水样品中施罗氏弧菌的检测限度可达1.3×10~2 CFU/mL。【结论】建立的钙黄绿素-LAMP检测技术具有很好的特异性、灵敏度和准确性,其操作方法简单、方便,无需昂贵仪器,适用于野外现场珊瑚致病菌施罗氏弧菌的快速检测。