人类肠道菌群与疾病关系的元基因组学研究进展

人体的生理健康除受自身基因的调控外,还受到肠道菌群的影响。人体肠道内的细菌有1 000～1 150种,其中160种为优势菌种,存在不同类型的生态学相互作用。肠道细菌的300多万个基因被视为人类的"第二基因组",在正常人体健康状态下,肠道微生物种群处于平衡状态,而在宿主患病期,菌群失调或紊乱。采用元基因组学研究能在更高更复杂层次上揭示肠道菌群之间的生命运动规律。本文系统综述了元基因组学对肠道菌群与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等疾病之间关系的研究进展。     

羊布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析

分泌蛋白是指那些分泌到细胞外的蛋白质。布鲁氏菌的分泌蛋白可能介导了病原与宿主之间的相互作用, 在布鲁氏菌的毒力方面发挥一定的作用, 但是研究方法的局限性限制了分泌蛋白的研究。本文报道了利用蛋白质组的方法来寻找羊布鲁氏菌的分泌蛋白。首先用TCA-丙酮法提取布鲁氏菌培养上清中的分泌蛋白, 双向电泳进行分离, 然后用质谱来鉴定这些蛋白, 最终鉴定到40种蛋白。通过生物信息学分析, 发现这些蛋白主要是ABC转运系统的底物结合蛋白、外膜蛋白和热休克蛋白。这些蛋白的识别不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的理解, 而且也可为     

布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立

[目的]由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点.[方法]本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5△BP26.分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力.根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株.[结果]成功构建了.BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为1022.9 ,而突变株为101.1 (P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2 ,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱.根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫.[结论]基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础.     

Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用

在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成：α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35~60 bp即可发生同源重组,且重组效率高。 Abstract:Since many DNA-sequencing projects of varied microorganisms have been completed,studies on their functional genomics become more important.Inactivation of an interesting gene is a direct method to characterize its function.Though the Esherichia coli RecA recombination system can be used to produce gene mutants,it needs a complex manipulation process.Furthermore,its efficiency is very low.Recently a Red recombination system was developed.This recombination system consists of three proteins:α protein（λ exonuclease）,β protein and Gam protein.In this system,the linear targeting DNA which contains a selectable marker flanked with a homologous region as short as only 35~60 bp can be directly targeted for gene knock-out with a higher efficiency.     

转座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用

转座子是DNA插入因子的一种,是指能在基因组间或组内跳跃的DNA片段。转座子作为插入突变剂或分子标签已被广泛地应用于基因的分离和克隆,且因其独特的性质已成为发现新基因和基因功能分析的有效工具。这使得转座子无论是在单基因水平还是全基因组水平,都成为细菌、酵母和其他微生物研究的有力工具。简单而有效的体外转座反应可以对一些以往难以进行分析的顽固微生物进行转座诱变分析。而建立在转座子基础上的信号标签诱变技术和遗传足迹法的应用则发现了一些新的病原微生物毒力因子,从而可以更好地对这些病原微生物的致病机理进行阐述。这些再次说明转座子是微生物功能基因组研究中的有力工具。本文综述了转座子及其衍生载体介导的一些技术,并讨论其在微生物功能基因组研究中的应用。     

pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用

突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。本研究构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,我们构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因的突变株。结果表明,利用该自杀质粒,通过一轮筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。pUC19K质粒的构建及成功应用,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一个快速有效的手段,也为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础。     

新型促细胞粘附重组人源性胶原的原核表达及功能性研究

选择一段与COL1A1基因相应序列同源、适合于在大肠杆菌E.coli中表达、含有编码促细胞粘附位点GER三肽密码子的基因序列。利用RT-PCR技术自人组织扩增该序列,构建pET28a(+)-COL重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。IPTG诱导表达获得重组人源性胶原RHDC, 表达量达到菌体总蛋白的40%左右。SDS-PAGE和Western Blot结果推测该胶原具有三螺旋结构。细胞粘附试验证明RHDC具有促细胞粘附能力,具有应用在生物材料领域的潜力。     

应用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌体内表达基因

为寻找新型抗结核药物靶标 ,采用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌的体内诱导基因。首先构建了结核分枝杆菌基因组质粒表达文库 ,库容量为 1 0 2× 1 0 5CFU。再用经过结核分枝杆菌和大肠杆菌的裂解产物吸附过的结核病人血清 ,通过原位免疫印迹来筛选基因组表达文库 ,共获得 1 6个阳性克隆。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析 ,发现该 1 6个阳性克隆可能包含 2 2个开放阅读框 (ORF)。按照功能将其分为 7类基因 :脂类代谢 2个、信号途径 5个、PE/PPE蛋白家族 2个、中间产物与能量代谢 6个、细胞壁与细胞处理 1个、假想蛋白 4个和与牛型分枝杆菌定向进化同源的 2个 ,其中部分基因可能与毒力相关 ,可以作为候选药物靶标     

一种体内研究病原体致病机理的新方法——信号标签诱变技术

信号标签诱变技术是以整个基因组为基础的研究病原体致病机制,可在体内对毒力基因进行高通量筛选的一种新方法。近几年应用该技术已对十多种病原微生物进行了筛选。这些筛选中除了找到已知的毒力基因外,还都鉴定到了未知的毒力因子。本文就该技术的原理、优缺点、应用的必要条件、技术的改进及应用该技术鉴定到的毒力基因等作一综述。 A Novel Approach to Study Pathogenesis of Pathogens in vivo——Signature-tagged Mutagenesis YAO Xiao1,2,HUANG Liu-yu1,YANG Bo-lun2,SU Guo-fu1 1.Beijing Institute of Biotechnoloy,Beijing 100071,China; 2.College of Environmental and Chemical Engineering,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China Abstract:Signature-tagged mutagenesis (STM) is a novel approach to study pathogenesis of pathogens and to screen virulence genes with high throughput in vivo,which is based on whole genome of pathogen in question.In resent years,more than ten species of microbial pathogens have been screened with this technology.There are also unknown virulence factors being identified with exception of known virulence genes identified in all these screens.This article reviews the principle,advantages and current limitations,the requirements,modifications of STM,and to date virulence genes identified by this technology. Key words：signature-tagged mutagenesis;virulence genes;pathogens;in vivo     

肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子的变化简

目的：观察肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子水平的变化。方法：通过CCL灌胃构建小鼠的肝硬化模型;采用酶联免疫吸附法检测肝硬化进程中血清内毒素及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平的变化;采集肝硬化小鼠新鲜粪便,通过荧光定量PCR实验检测肠道目的菌群的改变。结果：肝硬化小鼠肠道中拟杆菌属和梭菌属细菌显著减少,韦荣球菌属、肠杆菌属和肠球菌属细菌显著增加;随着肝硬化进程的加重,小鼠血液中内毒素及炎性因子水平显著提高。结论：肝硬化导致小鼠肠道菌群失调,促进了血液中内毒素及炎性因子水平的提高,形成恶性循环。