人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

北京地区住院患儿WU多瘤病毒感染的流行病学研究

自2007年Gaynor A M等人通过高通量测序在肺炎患儿呼吸道样本中发现了WU多瘤病毒(Washington University polyomavirus,WUPyV)以来,WUPyV在世界各地被广泛检出。为了解北京地区急性呼吸道感染住院儿童中WUPyV感染情况及其临床特征,收集北京地区2017年4月至2018年3月共1 276份呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本,使用real time PCR方法对样本进行WUPyV检测,同时对WUPyV阳性样本进行17种常见呼吸道病毒筛查。共检出WUPyV阳性样本76份(5.96%,76/1 276),4岁以下儿童居多(92.11%,70/76);WUPyV感染全年可见,无显著季节性;多伴随其他呼吸道病毒混合感染(60.53%,46/76),最常见混合感染为鼻病毒和A型流感病毒;WUPyV单一感染者与混合感染者病毒载量无显著性差异,临床诊断和表现基本一致;WUPyV感染患儿的常见诊断为支气管炎(68.42%,52/76)和肺炎(30.26%,23/76);临床症状主要表现为高热、咳嗽、咳痰。研究结果提示WUPyV是北京地区急性呼吸道感染住院患儿呼吸道样本中常见病毒之一,多见于4岁以下儿童。     

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本.方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同.结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景.     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究

目的:利用大肠杆菌系统表达重组人Ⅲ型干扰素λ1(rhIFN-λ1),并进行纯化,以比较其与重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)生物学活性的差异。方法:密码子优化的rhIFN-λ1基因与pET-44a载体连接构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经系列层析纯化;采用细胞病变抑制法比较纯化的rhIFN-λ1与rhIFN-α2b、市售rhIFN-λ1的抗病毒活性;采用MTS法比较这些干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。结果:基因优化后的rhIFN-λ1在大肠杆菌中得以高效表达,用所建立的纯化工艺可制备得到纯度达95.7%的rhIFN-λ1;rhIFN-λ1的抗病毒比活性为3.2×105 U/mg,比市售rhIFN-λ1的比活性(1.1×105 U/mg)略高,抗肿瘤细胞增殖活性为rhIFN-α2b的1.7倍。结论:获得的rhIFN-λ1具有剂量依赖的抗病毒活性和抗增殖活性,其抗病毒活性比市售rhIFN-λ1略高,抗细胞增殖活性高于rhIFN-α2b,提示rhIFN-λ1有较大的应用前景。     

人偏肺病毒在传代细胞和人呼吸道上皮细胞中分离和鉴定

人偏肺病毒（Human metapneumovirus,HMPV）是2001年鉴定出的新发呼吸道病毒,婴幼儿、老人和免疫抑制人群易感,引起上呼吸道和下呼吸道感染,目前尚无疫苗和特异性治疗方案。为获得北京地区HMPV临床流行毒株,本研究将经荧光定量PCR检测为HMPV阳性的鼻咽抽吸物样本分别接种LLC-MK2、Vero-E6和分化良好的人呼吸道上皮细胞（Human Airway Epithelium,HAE）,观察细胞病变、检测免疫荧光、电镜观察病毒形态、测定病毒滴度及分析复制特点,对分离获得的HMPV分离株进行鉴定。结果表明,HMPV感染LLC-MK2细胞可形成合胞体,但在Vero-E6中多呈单个细胞感染;经免疫荧光检测,HAE、LLC-MK2和Vero-E6细胞均可见绿色荧光;电镜结果可见病毒为近似球型的颗粒,有包膜和刺突,直径约在150nm～200nm之间;HMPV在HAE和LLC-MK2两种细胞上的复制特点基本相同。本研究成功建立了临床样本在LLC-MK2、Vero-E6和HAE分离培养HMPV的方法,分离并鉴定了HMPV临床分离株,为HMPV感染机制的研究奠定基础。     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。