青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

布氏鲳鲹GHRH基因克隆、组织和胚胎表达模式

促生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)主要生物学功能是刺激垂体细胞分泌生长激素,已被证实是动物体生长轴的重要调控因子之一,布氏鲳鲹是一种生长快速的海洋鱼类,为了揭示其代谢旺盛的调节机制,本研究从GHRH入手,利用RACE技术和qPCR方法对布氏鲳鲹GHRH基因进行了克隆、组织和胚胎表达模式研究。实验结果显示,布氏鲳鲹GHRH基因cDNA序列全长1019bp,5’UTR、3’UTR长度分别为327 bp和164 bp,开放阅读框528 bp,共编码175个氨基酸;同源性分析结果表明,布氏鲳鲹GHRH基因与其它鲈形目鱼类的同源性在91%以上。布氏鲳鲹GHRH基因的表达区域大多都集中在中枢系统,其中下丘脑表达量最高;GHRH在受精卵期到后续发育过程中均检测到表达,其表达水平在仔鱼期达到最高。序列分析、组织及胚胎表达的结果表明,布氏鲳鲹GHRH的调节模式仍然可能通过下丘脑调节垂体释放GH,GHRH在个体发育的较早阶段即开始发挥作用。本研究掌握了布氏鲳鲹GHRH基因的基本规律,为进一步研究生长轴的调控提供了理论参考。     

云斑尖塘鳢消化酶活力的研究

本文采用酶学分析方法研究了云斑尖塘鳢在正常摄食状态与饥饿的状态下胃、肠及肝胰脏组织中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。结果显示,在30℃的条件下,正常摄食组样本在酸性条件下的蛋白酶活力表现为:胃后肠肝胰脏前肠,中性和碱性条件下:后肠肝胰脏前肠及胃;饥饿组样本仅有胃表现出较高的酸性蛋白酶活性,其他器官的蛋白酶活性均很低。在正常和饥饿实验组中肝胰脏的淀粉酶活性均高于其他器官,胃肠的淀粉酶活性均较低。正常摄食组中脂肪酶活力后肠肝胰脏;而在饥饿组中仅有肝胰脏检测到脂肪酶活性。结果表明,云斑尖塘鳢适度饥饿组较正常摄食组消化酶活性大幅降低;其高蛋白酶活力及中等脂肪酶活力与其肉食性相一致;此外云斑尖塘鳢也具备少量的淀粉消化能力。     

转青鱼生长激素基因异源四倍体鲫鲤

生态安全性是转基因鱼走向市场的瓶颈,通过转基因四倍体鱼同转基因二倍体鱼杂交获得不育的转基因三倍体鱼是解决该问题的有效途径之一.本研究构建了青鱼β-actin基因启动子和青鱼生长激素（GH）基因精确连接的＂全鱼＂基因pbcAbcGHc;并采用显微注射法将pbcAbcGHc导入异源四倍体鲫鲤受精卵.对照养殖结果表明,150日龄的转基因异源四倍体鲫鲤原代（P0）的体重及体长明显大于对照组.选择60尾P0代转基因异源四倍体鲫鲤,采用PCR方法检测出外源青鱼GH基因在P0代转基因四倍体尾鳍基因组DNA中的整合率为90%;对20尾雄性P0代转基因四倍体精液样本的PCR检测发现,13个样本具有外源青鱼GH基因的整合.在一尾生长速度显著的P0代转基因四倍体鲫鲤的肌肉、肝脏、肾脏和卵巢组织中可检测到外源青鱼GH基因的转录.本研究成功获得了具有明显生长优势的P0代转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤,为建立转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤纯系和研制不育的转基因三倍体鱼奠定了基础.     

青鱼β-actin基因克隆及其启动子功能的初步检测

高保真PCR克隆青鱼β-actin基因开放阅读框和5’端侧翼序列,DNA测序结果表明：青鱼β-actin基因开放阅读框编码一段含375个氨基酸的蛋白,与其他物种actin家族相比较具有高度保守性。青鱼β-actin与鲤鱼、草鱼及斑马鱼的同源性均为100％,而与人和Norway鼠β-actin的同源性均为99.2％,与鸡和Kenyan爪蟾β-actin的同源性分别为98．9％和98．1％。将青鱼β-actin基因5’端启动调控区插入不含启动子的pEGFP1载体构建青鱼β-actin启动子／EGFP表达载体,与第一次卵裂之前显微注射该重组质粒入泥鳅受精卵,同时也用该重组质粒转染HeLa细胞系。观察结果表明：GFP在50％的泥鳅胚胎和2／3的HeLa细胞有所表达。GFP在泥鳅胚胎的各个部分均有表达,且在某些胚胎中GFP的表达遍布全身。因此,以EGFP为报告基因证实了青鱼β-actin基因启动子为一种非特异性表达的启动子。     

波纹唇鱼消化系统的组织学

采用组织切片技术,研究了波纹唇鱼消化系统的组织结构,并描述了该鱼消化系统的形态构造.波纹唇鱼隶属降头鱼科,为肉食性无胃鱼类.波纹唇鱼消化道包括口咽腔、食道、小肠、直肠和肛门.口咽腔内具有发达的颌齿和咽齿.肠道短而粗,在体腔内形成一个弯曲,比肠长0.43±0.02;食道的黏膜褶皱、黏膜下层、环肌层和纵肌层发达.小肠的黏膜下层、环肌层、纵肌层、浆膜层比直肠更薄.小肠前部的黏膜下层、浆膜层比小肠后部更厚.小肠黏膜层中的吸收细胞密度少于直肠,杯状细胞密度高于直肠.波纹唇鱼的口腔和舌的黏膜上皮为复层扁平上皮,有大量圆形黏液细胞存在.口腔和舌上有味蕾.食道黏膜层发达,基部有一种"凹"型结构,大量的巨型黏液细胞分布其中,该结构具有外分泌腺的结构特征,其"凹"型结构的开口在食道腔.小肠和直肠的微绒毛为单层柱状上皮组织,其间分布有3种杯状细胞,黏膜下层还分布有许多细胞质被染成红色的嗜酸性颗粒细胞.小肠前部黏膜上皮下含有脂肪颗粒,直肠上皮层中也含有被伊红染成红色的嗜酸性颗粒细胞.食道与小肠,小肠与直肠交界处存在瓣膜,瓣膜内的肌肉层均为横纹肌组成.肛门的黏膜层含有大量的椭圆形黏液细胞.波纹唇鱼的消化腺由肝胰脏和胆囊组成,肝脏分三叶,呈枫叶状,比肝胰脏重为1.5%±0.2%;胰脏沿肝血管弥散性分布在肝脏内,胆囊呈椭圆形,体积较大.并讨论了波纹唇鱼肠道的分段、消化道的组织特点与食性的关系等问题.     

体色差异豹纹鳃棘鲈的色素及酶含量分析

鱼类体色发育在生物进化、生理生态等方面具有重要的意义,豹纹鳃棘鲈是一种体色变异丰富的珊瑚礁鱼类,在不同环境中呈现出显著差异的体色。本文选取了豹纹鳃棘鲈体色差异个体,并对不同部位的皮肤颜色、色素分布和相关色素酶含量进行了检测和分析。结果显示,鱼体表皮分布着大量黑色素细胞和红色素细胞。黑色个体的黑色素细胞密度较大、黑色素含量较高,黑色素酶含量较低;而红色个体的红色素细胞密度更大、胡萝卜素与类胡萝卜素含量更高,黑色素酶的含量也更高。实验结果表明,豹纹鳃棘鲈的体色差异与黑色素颗粒的聚集、分散程度以及黑色素代谢酶的含量相关,体色鲜艳程度与红色素细胞数量以及胡萝卜素和类胡萝卜素含量相关。本文解释了红黑豹纹鳃棘鲈体色在色素和酶含量方面的差异,为进一步研究其体色变异机制提供了理论依据。     

鞍带石斑鱼精子诱导斜带石斑鱼雌核生殖

石斑鱼性成熟时间长和雌雄同体的特性延长了其育种的周期, 采用人工雌核生殖策略能够显著提高选育效率。研究筛选了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)精子人工诱导斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)雌核生殖的最佳条件, 并通过形态学、流式细胞术和微卫星分子标记等方法进行鉴定。结果显示, 灭活的异源精子可成功诱导斜带石斑鱼人工雌核生殖, 精子灭活的最佳紫外照射强度为518 mJ/cm2; 卵子受精后6min在4—6℃的条件下进行冷休克处理, 可获得最优的40%的表观受精率(卵子正常分裂比率)和29.7%的孵化率, 而未冷休克的对照组具有83.5%的表观受精率和80%的单倍体率。多重比较结果表明, 在表观受精率方面人工诱导的时间差异(P=0.579)和水温差异(P=0.133)并不显著; 而在孵化率上, 处理时间组间差异极显著(P=0.002), 而在水温组中差异不显著(P=0.396)。胚胎发育结果显示, 人工雌核生殖诱导会导致孵化率降低, 单倍体胚胎出现明显的发育障碍。微卫星分子标记鉴定结果显示, 石斑鱼人工雌核生殖子代的遗传物质大部分来自于母本, 同时也存在异精效应。     

禁食及进餐前后对布氏鲳鲹缩胆囊素表达的影响

缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)是生物体中抑制生物食欲的饱食信号因子,布氏鲳鲹属于摄食代谢十分旺盛的鱼类,揭示其CCK的表达规律能够进一步揭示鲳鲹的代谢机制。本研究开展了布氏鲳鲹禁食及餐前餐后养殖实验,并利用荧光定量PCR技术对布氏鲳鲹的缩胆囊素的表达模式进行了分析。在餐前餐后实验中,结果表明布氏鲳鲹下丘脑中的CCK的表达量在餐后0 h迅速上升达到峰值,随后在餐后1 h、3 h逐渐下降,并在+3 h下降至对照组水平。在禁食实验中,下丘脑中CCK的表达量在禁食阶段逐渐降低并在第5天下降至显著低于对照组,复投喂后在第7天又上升到对照组水平并保持至第11天。布氏鲳鲹CCK的表达对于饱食的信号反馈非常迅速,CCK的高表达与鲳鲹食欲控制相关。本研究结果可以为进一步研究布氏鲳鲹CCK基因的功能及调控提供理论参考。     

中国大鲵不同组织同工酶的比较研究

中国大鲵Chinese Giant Salamander(Andrias davidianus)是1869年被David[1]在中国西部发现的,俗称娃娃鱼、狗鱼、啼鱼,隶属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属,是世界上最大的珍稀有尾两栖类动物,被列为国家二级保护动物。曾广泛分布于我国中南部各省,是由水生脊椎动物向陆生脊椎动物过渡的类群,具有独特的科研和经济价值[2,3],从20世纪70年代起,很多学者[4—6]对大鲵的性腺发育、人工繁殖、胚胎发育及大鲵的资源状况和生态等方面做了一些研究,而有关中国大鲵同工酶方面的研究很少,同工酶的研究不仅有助于探讨个体发育过程中个体基因的表…