采用双抗体免疫沉淀技术分离和提纯大鼠肝细胞白蛋白mRNA

采用双抗体技术和Poly(U)-Sepha-rose 亲和层析法,分离和纯化出为均一的大鼠肝细胞白蛋白mRNA。把酸乙醇—硫酸铵分部和Sephadex G-150柱层析得到均一的大鼠血清白蛋白,免疫家兔得到抗血清,上白蛋白-Sepharose 柱,得到了纯的抗白蛋白抗体。用它与肝聚核糖体一起温育,得到合成白蛋白的聚核糖体。它们之间的结合是高度专一的,似乎是通过核糖体上的初生白蛋白多肽的免疫识别作用所致。反应的免疫复合物用第二抗体追踪,然后把聚核糖体—第一抗体—第二抗体复合物,通过一个不连续的蔗糖梯度,除去未反应的聚核糖体和抗体。用苯酚—氯仿—异戊醇(50∶48∶2)从免疫沉淀中分离出白蛋白聚核糖体RNA,上poly(U)-Sepharose 柱,得到大鼠肝细胞白蛋白mRNA。所分离白蛋白mRNA,在2%聚丙烯酰胺—0.5%琼脂糖凝胶电泳时为一条带。在依赖于mRNA 的麦胚无细胞蛋白合成系统中,所有的翻译产物由第一抗体识别,第二抗体追踪,用凝胶电泳法鉴定为真正的白蛋白——约有70—80%新生白蛋白多肽与天然白蛋白一起移动。麦胚抽提物的翻译分析表明,提纯的白蛋白mRNA 的活力可高达白蛋白pRNA 的53倍。     

红细胞血影介导7sRNA对大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)DNA复制、转录和甲胎蛋白合成的影响

本文总结了用红细胞血影介导正常肝7sRNA进入肝癌细胞的定位及其对细胞DNA复制、转录和蛋白合成的影响。装载~(125)I-78RNA的血影与肝癌细胞融合后,放射自显影标本显示7sRNA在细胞内的分布,主要定位于细胞质,也有见于细胞核内。7sRNA进入细胞后对细胞的DNA复制、转录和蛋白合成有抑制作用。免疫荧光和免疫沉淀法检测肝癌细胞甲胎蛋白合成的结果表明,7sRNA导入晚G_1期同步细胞后继续培养4小时,甲胎蛋白合成减少。由于细胞DNA复制和转录被抑制,在一定程度上影响了甲胎蛋白基因的表达。     

7SRNA在癌细胞中含量改变及其对染色质转录活性的调节

7s RNA与哺乳动物基因组中有300,000重复拷贝的Alu DNA顺序高度互补。Alu DNA的功能是与结构基因的转座和表达调控密切有关。因此7s RNA对基因表达可能有调节作用。本文提供实验:1.肝癌细胞核内7s RNA含量比正常核少,意味着减弱了对癌细胞基因表达的控制。2.7s RNA比其他的核小分子量RNA更紧密与染色质结合。3.7sRNA对离体染色质的转录活性有促进和抑制的两相作用,这些结果直接和间接表明7s RNA对基因表达起一定的调节作用。由于Alu DNA在基因组中分布是广泛性的,因此认为7s RNA的调控作用也应是一般控制性质的。     

正常肝信息核糖核酸的翻译和对离体肝癌细胞的逆转分化作用

正常肝信息核糖核酸是从肝聚核蛋白体抽提RNA,通过寡聚(dT)纤维素亲和层析制备。分离的正常肝mRNA在麦胚蛋白合成系统和爪蟾卵翻译系统检定,能够翻译白蛋白,由此证明是有生物学活性的。用正常肝mRNA在离体情况下对肝癌细胞进行逆转分化研究,发现:(1)小鼠正常肝mRNA能抑制小鼠腹水肝癌细胞核酸和蛋白质的合成;初步见到人的正常肝mRNA能轻度抑制人体肝癌细胞(BEL-7404)的生长。(2)相应的正常肝mRNA分别在小鼠腹水肝癌和人肝癌细胞诱导了白蛋白合成;在人体肝癌细胞内核蛋白体聚成聚核蛋白体。(3)人体肝癌细胞受刀豆凝集素(Con A)凝集的能力减弱,这种凝集特性的改变,可以维持至3次细胞传代。这些实验结果显示肝癌细胞并非固定不可改变的,在正常肝mRNA作用下能够向正常逆转分化;讨论了mRNA转化机理,认为可能是通过肝mRNA翻译的蛋白质或mRNA本身直接调节基因转录来实现的。