羊骨胶原肽对青春期大鼠催乳素和促黄体生成素分泌脉冲的影响

目的研究羊骨胶原肽(sheep bone collagen peptide,SBCP)对类固醇诱导的去卵巢大鼠催乳素(pro-lactin,PRL)和促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)分泌脉冲的影响。方法 6周龄子宫颈未开口的青春期SD大鼠实施双侧卵巢摘除手术,康复1周或3周后以类固醇替代方法诱导PRL和LH脉冲,处理组同时按1000 mg/(kg.d)的剂量以SBCP灌胃,通过颈导管采集血样,利用放射免疫技术测定各组大鼠外周血中的LH和PRL浓度。结果对于术后康复1周的大鼠,SBCP对LH脉冲振幅起到增强作用,而对PRL脉冲没有影响;对于术后康复3周的大鼠,SBCP对LH和PRL脉冲振幅均表现为降低作用,但卵巢摘除后立即给予SBCP可减弱这种降低作用。结论雌激素和孕激素替代注射的同时,补充羊骨胶原肽,不仅仍可诱导LH和PRL脉冲的产生,还可预防由于卵巢摘除带来的骨代谢紊乱,免疫力低下等不良影响,因而是对现有类固醇替代方法的改良。     

枯草杆菌可溶性YlyA蛋白的诱导表达与纯化研究

YlyA是枯草杆菌一种功能未知蛋白.本研究旨在建立可溶性YlyA的诱导表达体系和纯化方法,为其功能研究奠定基础.PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSⅢ中构建表达载体pNG252,用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析,最后对可溶性YlyA重组蛋白进行Ni2+-WTA亲和层析加以纯化.结果表明pNG252中ylyA的插入方向正确,序列无突变;用0.5 mmol/L IPTG,37℃诱导3 h时,YlyA虽高效表达,但为包涵体形式;调整诱导条件至0.05 mmoL/L IPTG,25℃,5 h时,高效表达的YlyA部分转为可溶性蛋白.纯化后的YlyA浓度达204.2119 μmoL/L;调整洗涤液中的咪唑浓度至15 mmol/L,pH至9,可使纯化蛋白的产量大幅提高.本文成功构建了YlyA高效可诱导表达载体,建立了可溶性蛋白的诱导表达条件,确立了Ni2+-NTA亲和层析纯化方法,所得的6×His-YlyA融合蛋白,可用于YlyA晶体结构和与功能分析.     

羊骨酶解液的植物乳杆菌发酵

为进一步提高羊骨酶解液的营养价值和生物利用度,探讨乳酸菌发酵对钙离子释放、短肽形成以及酶解液抗氧化活性的影响。首先从7株乳酸菌中筛选出了产蛋白酶能力最强的植物乳杆菌,接种羊骨酶解液,以发酵液中Ca~(2+)浓度为指标,响应面法优化得到发酵工艺:酶解液中添加1%的麦芽糖,调节起始pH为5.5,以4%接种量接种驯化好的植物乳杆菌,37℃摇床发酵14 h。发酵过程中,植物乳杆菌活菌数与Ca~(2+)含量(R=0.495,P0.01)和短肽得率(R=0.655,P0.01)呈极显著正相关,而多肽生成量与短肽得率呈负相关(R=–0.013)。发酵液中的Ca~(2+)浓度(P0.05)、水解度(P0.01)、短肽得率(P0.01)、羟脯氨酸含量(P0.01)均显著高于酶解液(P0.01),植物乳杆菌活菌数达到94.6×10~8 CFU/m L。发酵还可使酶解液对DPPH、·OH、O_2~-·三种自由基的清除能力显著提高(P0.01,P0.05)。综上所述,以植物乳杆菌发酵羊骨酶解液可进一步促进骨钙的转化和胶原短肽的生成并显著提高其体外抗氧化能力,短肽和Ca~(2+)反过来促进植物乳杆菌的繁殖,增强了酶解液的益生功能,乳酸菌产生的维生素、胞外多糖等物质使羊骨酶解液更富营养。     

肌肉中钙蛋白酶-3的研究进展CSCD

钙蛋白酶(calpain/CAPN)是参与一系列生物活动的钙调节蛋白酶。在细胞内,calpain通过对底物限制性的水解来调节蛋白质的各种功能。钙蛋白酶-3(CAPN3),也称p94或calpain-3,是一种骨骼肌特异性的蛋白酶,具有其他calpain甚至是其它蛋白酶所不具有的特性:CAPN3能够快速、彻底地自动降解,并且可以通过分子内互补作用(intermolecular complementation, iMOC)重新获得活性;CAPN3是细胞内迄今为止唯一的依赖于Na+激活的酶等。此外,基因突变导致CAPN3蛋白缺失会引起肢带型肌营养不良2A症(limb-girdle muscular dystrophy type 2A, LGMD2A)。本文综述了CAPN3从发现到目前的研究进展,同时对该领域的研究趋势进行了讨论和展望。     

细胞融合技术的发展及应用

细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。     

枯草杆菌ylyA基因的绿色荧光蛋白标记

[目的]本研究对枯草杆菌ylyA基因进行荧光标记以便对其产物YlyA在菌体中的位置进行初步观察.[方法]以不同菌株基因组DNA为模板,对ylyA基因进行PCR扩增和序列分析;重新设计引物扩增全长的ylyA并将其克隆到载体pSG1729中,形成gfpmut1-ylyA融合而构建重组载体pNG426;将pNG426转化枯草杆菌168菌株,双交换使gfpmut1-ylyA插入染色体的amyE位点,用碘染色法和菌落PCR对阳性转化子BS363进行鉴定.NA固体培养基上生长的BS363经0.5%木糖诱导表达后,利用表面荧光显微镜技术进行观察.[结果]通过对多个PCR产物的序列分析确定了ylyA基因的正确序列以及正确的翻译起始位点;成功将重组载体pNG426转化枯草杆菌得到了BS363菌株;荧光检测结果表明GFP标记的YlyA分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列.[结论]生长缓慢的BS363菌体,在0.5%木糖诱导下产生的荧光标记YlyA蛋白分布在细胞外周,可能在膜生物学中发挥作用.     

羊骨酶解发酵液钙鳌合物对骨质疏松大鼠骨密度和骨代谢生化指标的影响

目的探讨羊骨酶解发酵液钙螯合物（SBEF-Ca）对雌激素缺乏造成的骨质疏松的防治作用。方法 40只3.5月龄的Sprague-Dawley大鼠,按体重随机分为正常组（假手术＋蒸馏水）、模型对照组（去卵巢＋蒸馏水）和高、中、低3个剂量组（去卵巢＋SBEF-Ca）。术后12 d,持续灌胃11周后,测定股骨密度、长度以及血清中反映骨代谢的主要生化指标。结果模型对照组大鼠股骨密度和长度显著减小,各剂量组均可扭转这种减小趋势并使股骨密度和长度维持在正常组水平,其中高剂量组的股骨密度显著大于中、低剂量组;各剂量组的股骨长度差异不显著;所有大鼠的血Ca、血P水平差异无显著性;模型对照组的血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）水平明显升高,而各剂量组的ALP、BGP水平与正常组差异不显著,且高剂量组ALP水平显著低于中、低剂量组,中、高剂量组的BGP水平（P〉0.05）显著低于低剂量组。结论低、中、高剂量的SBEF-Ca对绝经后骨质疏松症有预防作用。     

羊骨木瓜蛋白酶水解物对小鼠免疫功能的影响

目的探讨不同剂量的羊骨木瓜蛋白酶水解物对健康小鼠免疫功能的影响。方法按体质量将ICR小鼠分成对照组(0g/(kg·bw))及低(0.5g/(kg·bw))、中(1.0g/(kg·bw))、高(3.0g/(kg·bw))3个剂量组,分别以碳粒廓清试验和溶血试验评价水解物对非特异性免疫和体液免疫的影响;以噻唑蓝分光光度法评价低(0.01mg/mL)、中(0.1mg/mL)、高(1mg/mL)不同浓度水解物对细胞免疫功能的影响。结果只有中剂量水解物才能显著提高吞噬细胞的吞噬能力;3个剂量组小鼠脾细胞的抗体生成量均显著高于对照组,但高剂量组显著低于中、低剂量组;3个浓度的酶解物均能促进体外ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性,但高浓度的促分化效果不如低浓度和中浓度。结论羊骨木瓜蛋白酶水解物能增强小鼠的特异性和非特异性免疫功能,但这种免疫促进作用与剂量并不呈线性关系。     

枯草杆菌ylmK基因的荧光标记及Ylmk蛋白的亚细胞定位

目的：对枯草杆菌ylmK基因进行3’端荧光标记以便对其产物YlmK蛋白在菌体中的位置进行初步观察。方法：以BS168菌株基因组DNA为模板,PCR扩增ylmK基因的3’端序列,并将其克隆到载体pSGll64中,形成ylmK’-gfpmutl融合,构建重组载体pNC-424;将pNG424转化枯草杆菌168菌株,单交换形成完整的功能性3’端gfpmutl标记的ylmK基因,菌落PCR对阳性转化子BS362进行鉴定,用表面荧光显微镜技术对BS362进行观察。结果：荧光检测结果表明GFP标记的YlmK分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列。结论：YlmK是一种膜蛋白。     

YlyA和RNA聚合酶的反应性鉴定

目的：用亲和层析法鉴定YlyA与RNA聚合酶（RNAP）的结合性能。方法：将YlyA分别上样于以Affigel 15为亲和介质制备的空白柱、牛血清白蛋白（BSA）柱和RNAP柱;以GreA和绿色荧光蛋白（GFP）为阳性和阴性对照蛋白分别上样于同一RNAP柱,洗涤和洗脱缓冲液（pH均为7．9）的盐离子浓度分别为30mmol／L和400mmol／L;用免疫印迹法对洗涤和洗脱流出液中的YlyA进行检测。结果：在空白柱和BSA柱的洗脱收集液中,没有检测到YlyA,大量的YlyA出现在了洗涤收集液中;而在RNAP柱的洗脱收集液中,检测到了YlyA和GreA,没有检测到GFP。结论：YlyA与RNAP之间具有特异性结合能力,为YlyA极有可能是一种转录因子的生物信息学分析结果提供了实验证据。