柑橘黄龙病菌内参基因的筛选与评估

【背景】柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,主要由候选韧皮部杆菌属亚洲种("Candidatus Liberibacter asiaticus",CLas)引起。CLas全基因组测序已经完成,因而该病原菌的基因表达研究和功能验证得以进行。【目的】筛选CLas内参基因并评估其不同侵染时期和在不同品种植物寄主中的表达稳定性。【方法】基于基因功能类别,利用实时荧光定量PCR技术分析23个CLas的候选内参基因相对表达情况(16Sr RNA基因作为参照基因)。结合Ct值标准差和geNorm、NormFinder、RefFinder软件,评价内参基因的表达稳定性。【结果】在感染黄龙病不同时期和不同品种的植物寄主样本中,14对引物表现出较强的特异性和稳定性。内参基因稳定性排名:ftsZgyrArpoB1ftsAsecAgapzapEgmk2rpoDsecYrpoOftsWgmk1recA,根据geNorm配对变异值Vn/n+1选择稳定性最好的ftsZ和gyrA作为内参基因作进一步评估。以ftsZ+gyrA以及16S rRNA基因分别作为内参基因检测柑橘黄龙病菌致病基因LasΔ5313的表达水平,所得的表达模式相同。【结论】柑橘黄龙病菌中涉及DNA复制和细胞分裂功能的管家基因表达较稳定,在CLas的基因表达研究中可选择ftsZ+gyrA的基因组合作为内参。本研究为后续利用实时荧光定量PCR分析CLas基因表达及研究CLas致病机理奠定基础。     

长春花过氧化物酶PwPOD基因克隆及其在黄龙病菌侵染后的表达变化

为获得长春花(Catharanthus roseus)过氧化物酶(peroxidase,POD)基因的全长cDNA序列以及黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)侵染后长春花POD基因(PwPOD)的表达情况,本研究根据不同作物POD基因的同源性,筛选出长春花过氧化物酶基因的引物,采用SMARTer-RACE方法扩增其3′和5′末端,运用qRT-PCR的分析病原感染后不同时间长春花叶、主茎和根中PwPOD基因的mRNA转录水平的变化。经拼接后获得PwPOD的全长cDNA序列,该基因全长1 611 bp (GenBank登录号KT032115)。生物信息学分析表明,该基因与其他已知物种的POD基因同源性达89%,编码一个无跨膜结构域,N末端含有信号肽的稳定蛋白。分析染病后长春花各组织中PwPOD的表达发现其表达量随着感染时间的增加呈先升后降的趋势,分别在嫁接后第30天(叶片)、第35天(主茎)和第35天(根)达到峰值,表达量分别上调12.8倍、3.96倍和5.53倍。证实PwPOD的表达确实受到黄龙病菌侵染的诱导,其表达量可能与寄主的抗病能力相关。