猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

ORF3蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的增殖

【背景】猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起,其大规模的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。由于对PEDV免疫机理及侵入机制知之甚少,至今仍缺乏有效的PED防治措施。【目的】研究orf3对PEDV体外增殖的影响。【方法】利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作技术拯救一系列携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV;将获得的重组PEDV以MOI 0.1感染Vero细胞,分别于感染的第8、16、24、32、40、48 h测定其TCID_(50)并绘制病毒生长曲线;分别在感染25 h和36 h利用全自动细胞计数分析仪对6孔板内的细胞进行计数,并于感染后的第12、24、36、48 h用CCK-8试剂盒对其细胞活力进行测定。【结果】RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因或orf3基因缺失的重组PEDV;进一步的免疫组化分析结果证实PEDV的ORF3蛋白可以在Vero细胞中合成。SPSS软件分析表明携带orf3基因的重组PEDV的滴度(TCID_(50))显著高于缺失orf3基因的重组PEDV的滴度;带有orf3基因的重组PEDV感染Vero细胞25 h和36 h时的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组病毒感染相同时间时的活细胞数;而且重组PEDV感染Vero细胞24 h后,带有orf3基因的重组PEDV的细胞活性显著高于缺失orf3基因的重组病毒。【结论】ORF3蛋白对于PEDV在Vero细胞中的增殖具有促进作用,该作用是通过延缓或减少感染细胞的死亡实现的。本研究为揭示PEDV orf3基因的功能和PEDV复制机制的研究提供理论基础。     

猪流行性腹泻病毒诱导的猪肠道-乳腺-sIgA轴以及免疫机制探讨

猪的“肠道-乳腺-sIgA轴”免疫通路是指侵染猪的胃肠道病原通过胃肠道免疫可以激发乳腺产生sIgA;sIgA被初生仔猪摄取可以获得针对胃肠道病原的被动免疫保护。该免疫通路的反应动力模式涉及病原侵染、抗原提呈、淋巴细胞活化、淋巴细胞的肠道和乳腺归巢以及抗体分泌等诸多环节,受到病原毒力、母猪的妊娠阶段及免疫生理状态等众多因素影响。目前,猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）诱发的“肠道-乳腺-sIgA轴”的理论可以解释自然感染状态下哺乳仔猪获得的被动免疫保护,但根据这一概念所设计的疫苗和免疫方案并未取得满意效果。本文综述了PEDV感染和宿主免疫各个环节的研究现状,分析了影响PEDV免疫和肠道-乳腺-sIgA轴系反应的关键病原和宿主因素,提出了在轴系理论基础上应重视PEDV灭活疫苗以及特异IgG作用的建议。     

猪流行性腹泻病毒免疫及疫苗研制

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属。文中综述分为5个部分。前两部分在介绍该病病原及其流行病学的基础上先概括了初生仔猪的被动免疫途径和初乳的重要功效。第三部分总结了母猪孕期免疫的特点,讨论了"肠道-乳腺-sIgA轴"理论及其可能的作用机理,提出了一系列PEDV免疫防控中应重点关注的理论技术问题。最后两部分分别总结了PEDV疫苗的研发现状并对PEDV免疫防控的未来发展作了展望。     

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40–91 aa是其细胞质定位的关键结构域

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。     

与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

牛传染性鼻气管炎可视化LAMP检测方法的建立和应用

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守序列(GenBank Accession No. DQ006857.1),利用Primer ExplorerV4软件设计3对LAMP引物,通过反应体系的优化、敏感性试验和特异性试验,建立IBRV的LAMP检测方法,并对393份临床样本进行了检测应用。结果显示,建立的IBRV LAMP方法在65℃、50 min条件下可扩增出LAMP特征性梯状条带,并可通过颜色变化判定结果。该方法可以检测到10copies/μL的质粒DNA,与nested-PCR方法的敏感性相当,比PCR方法敏感1000倍,且与牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、水泡口炎病毒等均无交叉反应。应用该方法检测301份鼻腔拭子和92份血清样本,阳性率分别为87.6%和58.8%,表明鼻腔棉拭子更适用于IBRV的临床检测。文中建立的IBRV LAMP方法具有可视化、快速、特异、灵敏性强的优势,适合基层和现场对临床样本进行快速检测,为IBR的防控提供了技术支撑。     

冠状病毒感染调控细胞凋亡机制研究进展

冠状病毒是常见的感染人类和动物并造成健康危害的主要病原性微生物之一,冠状病毒感染细胞后,细胞产生免疫应答,病毒为了在细胞内转录翻译和装配下一代,应对细胞免疫应答的同时,还参与到许多细胞活动中,当细胞特定受体与病毒蛋白结合后,细胞即启动凋亡程序。冠状病毒的许多蛋白在细胞凋亡程序中起促进或抑制凋亡的不同作用,如病毒S蛋白与细胞膜死亡受体作用诱导细胞启动外在凋亡途径,病毒感染细胞后产生的M、S蛋白引起细胞内质网应激、Ca2+失衡,诱导细胞启动内在凋亡途径,而E蛋白则抑制细胞凋亡的发生。本文综述了冠状病毒对侵染细胞的促凋亡或抑制凋亡作用及其作用机制,通过了解病毒不同蛋白在各种凋亡途径中的不同作用,希望为人工干预调控细胞研究提供思路,为冠状病毒感染防控提供理论支持。     

冠状病毒S蛋白及其受体的结构和功能

冠状病毒是有包膜的单股正链RNA病毒。作为人和动物的重要致病原,冠状病毒感染主要导致宿主呼吸系统、肝脏、胃肠道以及神经系统出现急性或慢性症状。2000年以来,传染性非典型肺炎和中东呼吸综合征的暴发,以及猪流行性腹泻病毒在全球猪群中的暴发流行,引起大家对动物冠状病毒的极大重视。S蛋白具有受体结合活性和膜融合活性,是冠状病毒感染细胞的关键蛋白;S蛋白在病毒的组织或宿主嗜性和毒力等方面发挥重要作用。本文重点对近年来冠状病毒S蛋白的结构、功能以及S蛋白与受体相互作用的研究进行综述,以期为冠状病毒的入侵机制和反向遗传学研究以及受体阻断药物的开发提供参考。