生物质多糖的高效降解与降解酶（系）的精确定制

自然界中多糖类生物质资源十分丰富,然而其复杂的抗降解屏障限制了生物转化的进程.近年来,随着生物质多糖结构的快速解析以及大量多糖降解酶的鉴定研究,针对不同底物结构或产物需求,仿制高效微生物多糖代谢途径,精确定制多糖降解酶系,促进生物质高效转化已成为可能.本文分析中性多糖(纤维素和木聚糖)、碱性多糖(几丁质和壳聚糖)以及酸性多糖(褐藻胶)的精细结构组成与基团性质,总结3类多糖主要降解酶的活性架构特征及其底物精确结合模式.文章还阐述蛋白质工程设计与定制策略,针对酶分子不同功能区的分析,可为酶分子的功能快速设计与改造提供靶点,以获得适宜于工业应用的高效酶分子,此外,根据微生物胞外降解酶系的降解次序与协同关系,可基于应用需求精确定制复杂多糖降解酶系,实现生物质的高效与高值降解转化.     

棘孢曲霉SML22木聚糖酶系主要组分的纯化与性

经超滤浓缩、分子筛色谱、阴离子和阳离子交换层析,由棘孢曲霉发酵液最终分离得到4个电泳纯的木聚糖酶主要组分Xy-1、Xy-2、Xy-3和Xy-4。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得各组分的分子量分别是92.13、32.40、42.40和27.03 kD。实验证明这些酶组分均属于酸性木聚糖酶,Xy-1、Xy-2、Xy-3和Xy-4的最适反应pH分别为5.0、4.0、4.6 和3～3.5。各酶组分在酸性条件下较稳定,碱性条件下酶活丧失较快。Xy-1及Xy-2的最适反应温度在75℃,在50℃以下比较稳定;Xy-3及Xy-4最适反应温度为55℃,在40℃以下比较稳定。通过对各酶组分米氏常数的测定可知,Xy-1及Xy-2对底物桦木木聚糖的Km值分别为0.36%和0.26%,Xy-3及Xy-4的Km值为2.46%和13.9%。4种组分的Vmax分别为4.01μmol/min/mg、8.81μmol/min/mg、81.97μmol/min/mg、4.71μmol/min/mg。Cu2+、Ag+对各组分都有较强的抑制作用, Mg2+、Ba2+、Ca2+能促进Xy-3的木聚糖酶活,Ca2+也可大幅度促进Xy-4的木聚糖酶活性。     

棘孢曲霉SM-L22木聚糖酶系主要组分的纯化与性质

经超滤浓缩、分子筛色谱、阴离子和阳离子交换层析 ,由棘孢曲霉发酵液最终分离得到 4个电泳纯的木聚糖酶主要组分Xy 1、Xy 2、Xy 3和Xy 4。通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测得各组分的分子量分别是 92 1 3、32 4 0、4 2 4 0和 2 7 0 3kD。实验证明这些酶组分均属于酸性木聚糖酶 ,Xy 1、Xy 2、Xy 3和Xy 4的最适反应pH分别为 5 0、4 0、4 6和 3～ 3 5。各酶组分在酸性条件下较稳定 ,碱性条件下酶活丧失较快。Xy 1及Xy 2的最适反应温度在75℃ ,在 5 0℃以下比较稳定 ;Xy 3及Xy 4最适反应温度为 5 5℃ ,在 4 0℃以下比较稳定。通过对各酶组分米氏常数的测定可知 ,Xy 1及Xy 2对底物桦木木聚糖的Km 值分别为 0 36 %和 0 2 6 % ,Xy 3及Xy 4的Km 值为 2 4 6 %和1 3 9%。 4种组分的Vmax 分别为 4 0 1 μmol min mg、8 81 μmol min mg、81 97μmol min mg、4 71 μmol min mg。Cu2 、Ag 对各组分都有较强的抑制作用 ,Mg2 、Ba2 、Ca2 能促进Xy 3的木聚糖酶活 ,Ca2 也可大幅度促进Xy 4的木聚糖酶活性。     

棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质*

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

快速展示糖苷水解酶活性架构单点突变导致结合力变化的电泳技术

酶分子在长期进化过程中形成一系列氨基酸残基组成的活性架构,参与底物的识别、结合与催化过程,而活性架构中相应氨基酸残基是如何影响酶分子结合底物的能力,进而影响酶分子的催化效率,一直是酶分子理性改造研究的热点.利用亲和电泳技术,可以快速展示内切纤维素酶Tr Cel12A和木聚糖酶Tl Xyn A活性架构中不同突变体的催化活性及其迁移率的变化,进而通过在不同底物浓度凝胶中蛋白质相对迁移率变化程度的定量回归分析,发现由氨基酸单点突变导致蛋白质迁移率的相对变化,可以定量表征酶分子突变前后结合底物能力的变化.亲和电泳测定的有效阻滞常数Kb值与等温滴定量热法和荧光光谱法测定的相关参数比较具有明显相关性.由于亲和电泳技术在测定酶分子与底物的结合能力时具有简便、快速、灵敏的特点,因而可作为常规生化实验室常规普筛技术来检测突变文库中系列突变体导致结合力的变化.     

裂解多糖单加氧酶高效催化的研究进展

裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶,常具有多种模块化组合,能够高效氧化降解生物质多糖.LPMOs的催化结构域为β三明治结构,活性中心含有一个铜离子.该酶的催化反应过程相对于糖苷水解酶类更加复杂,LPMOs结合底物后,首先要接受电子供体提供的电子,通过电子传递链传递给活性中心的Cu[Ⅱ],将其还原为Cu[Ⅰ],Cu[Ⅰ]结合并活化分子氧后,再氧化降解多糖链的糖苷键,生成氧化产物和非氧化产物.近年来的研究表明,在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率,因此LPMOs相关研究的深入开展可以拓展人们对其高效降解机制的认识,从而为高效降解酶系的复配以降低工业规模的生产成本等提供理论指导.本文综述了该领域相关研究的最新进展,分析了LPMOs潜在的研究方向与工业化应用的前景.     

虫花菌胞外糖蛋白的分离、纯化及其性质研究

虫花菌(Isaria farinosa(Dicks)Fr.)发酵液经超滤浓缩、乙醇沉淀、弱酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂去杂蛋白后,又经Sephadex G-150纯化得到PG。PG经醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和Sepharose 4B柱层析,证明是单一均匀的糖蛋白。PG的分子量为11.1万。PG的糖含量为92.35％、蛋白含量为7.61％。PG用气相色谱、红外光谱分析表明含有D-甘露糖、D-半乳糖,其摩尔比是5.93:1。推测PG主要含α-型糖苷键。PG对小鼠实体瘤S-180有一定的抑制作用,抑瘤率为22.2％。     

微生物学教学内容与课程体系改革的初步实践

山东大学微生物学学科是国家重点学科,现设有微生物学本科专业,微生物学硕士点和博士点。山东大学微生物学专业是我国国内成立最早、培养人数最多、开设专业课程最全的理科专业。在１９７７年恢复高考之后,我们逐步把微生物学专业的课程进行补充、扩大,经过二十年的努力,建立起了专业课程齐全的微生物学课程体系。这种课程体系对于学生扎实专业基础知识与能力的培养,起了重要的作用,使毕业生受到使用单位的广泛欢迎。 在新的形势下,面对２１世纪教学内容与课程体系的改革,原有的微生物学课程体系所存在的问题明显暴露出来,一是课…     

黑曲霉糖化酶热稳定性的研究

本文报导了黑曲霉糖化酶三种同工酶的相似的热稳定性。活力测定表明,糖化酶在60℃时易失活,三个同工酶的半衰期分别是GⅠ30’,GⅡ48.,GⅢ80’;而对40℃和50℃则有较强的抗性,但其活力曲线呈现复杂的变化,显示出在一定时间内,温热可以诱导酶活提高。紫外吸收及紫外差示光谱表明,在热处理过程中引起了酶分子的构象变化。本文还对酶分子的构象及活力变化的关系进行了探讨。 糖化酶(glucoamylase EC.3.2.1.3)水解淀粉为葡萄糖,是食品酿造工业的重要用酶之一。我们已经从黑曲霉AS.3.4.309变异株B-11发酵液中分离提纯了三种糖化酶的同工酶(1),并对其基本性质进行了研究。本文主要对黑曲霉糖化酶的热稳定性作了进一步的探讨。     

酿酒酵母中a-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson’s Disease, PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一。研究显示, a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用。以酿酒酵母为模式系统, 通过调控a-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响a-synuclein聚集状态的因素, 对a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究。结果表明, a-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性, 而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关; 超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解a-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制。上述结果表明, 蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在a-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用。