卡那霉素抗性基因在三孢布拉霉菌种中的表达

利用一个带有自主复制子,但缺失自身启动子的源于转座子Tn-5的卡那霉素抗性基因的质粒PVB32,在大肠杆菌中克隆丝状真菌三孢布拉霉DNA中有启动子功能的DNA片段;通过原生质体转化,获得了三孢布拉霉对卡那霉素抗性的表达,且抗性表现稳定,可通过孢子无性繁殖稳定遗传下去。     

微生物絮凝剂产生菌的筛选和发酵条件研究

设计了微生物絮凝剂产生菌菌种筛选模型,并从土壤和活性污泥中筛选到５１株絮凝剂产生菌,经复筛获得两株絮凝活性较高的菌株,分别定名为Ｎｏｃａｒｄｉａ,ＪＩＭ－８９和ＪＩＭ－１２７。对两株菌的发酵条件,特别是培养基组成,进行了初步研究。两株菌所产生的絮凝剂,对大肠杆菌悬液２０ｍｉｎ的絮凝活性在１０００ｕ／ｍｌ,最高可达１２４８ｕ／ｍｌ。     

新型甜味剂--赤藓糖醇产生菌的筛选

从土壤、酿造食品、花粉等样品中分离赤藓糖醇产生菌的方法,分离得到约３００株耐高渗酵母,其中有３株菌产赤藓糖醇,２６０８在葡萄糖培养液中可产赤藓糖醇３２ｍｇ／ｍｌ。     

E.coli ZB43生成Microcin B17的发酵研究

Microcin B17(简称MccB17)是核糖体合成的肽类DNA螺旋酶抑制剂,其独特的分子结构是抗菌剂未来发展的重要的新颖结构,MccB17产生菌的杂环形成机理对于制药工业的药物设计具有重要意义。MccB17产生菌E.coliZB43适宜在M63合成培养基中积累胞内MccB17,低溶氧水平利于MccB17的积累。当葡萄糖浓度超过1g/L时,MccB17的合成受到阻遏。采用均匀设计表U11(1110)进行发酵培养基配比调整,确定了最佳的含葡萄糖合成培养基配比:葡萄糖1g/L,KH2PO43g/L,K2HPO47g/L,(NH4)2SO41g/L,MgSO4.7H2O 1.8mmol/L,盐酸硫胺1.8μg/ml。丁二酸钠能解除葡萄糖对E.coliZB43生成MccB17的代谢阻遏。以10g/L丁二酸钠替代葡萄糖为唯一碳源,在上述最佳发酵培养基配比条件下,37℃24h,MccB17的产量可达559.6μg/ml。     

过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用。在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因prp C2,研究其对精氨酸及副产物合成的影响。重组菌C.crenatum SYPA5-5/p DXW-10-prp C2胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%。同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%。     

赤藓糖醇发酵工艺研究

赤藓糖醇的制备方法主要为微生物发酵法。为提高圆酵母(Torulasp.)B84512转化葡萄糖生产赤藓糖醇的发酵产量,采用控制发酵过程中葡萄糖起始浓度(30.0%)、中间流加葡萄糖浆的工艺使总葡萄糖糖浓度达到40%,发酵120h可产赤藓糖醇162.5gL,生产率为1.35gL·h,而不采取中间流加工艺,起始葡萄糖浓度为40.0%,发酵120h可产赤藓糖醇120gL,生产率为1.00gL·h。通过研究发现在赤藓糖醇发酵过程中采取中间流加葡萄糖工艺,能大大提高赤藓糖醇的发酵水平,提高幅度达30-35%,生产率也有相应提高。     

耐氨米根霉发酵生产L-乳酸的研究

传统的L-乳酸发酵法生产以CaCO3为酸中和剂,在乳酸后提取中产生的大量石膏废渣不仅在过滤时造成较大的乳酸损失,而且由于废渣不易处理,对L-乳酸万吨级规模的生产将形成巨大的环保压力和废渣处理成本。为此,为了降低L-乳酸生产成本,该文采用氨水为酸中和剂,用筛选得到的一株米根霉RhizopusoryzaeJS-N02-02进行以氨水为中和剂的L-乳酸摇瓶、15L自动发酵罐的发酵试验。以玉米粉双酶水解糖为碳源,接种孢子浓度1×105个ml,以0.01%(NH4)2SO4为氮源,30℃,15L自动发酵罐连续5批发酵,平均总糖浓度为136.8gL,平均产酸达100.6gL,L-乳酸纯度达95.3%,糖酸转化率达71.6%。     

利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统

热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C.tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C.tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C.tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisGPDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C.tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCmURA3-PDCm,并转化C.tropicalis XZX03菌株,获得转化子C.tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C.tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。     

多核丝状真菌的选育及遗传稳定性

细胞中多核体的存在,对其隐性突变体的分离及优良形状的稳定遗传产生了相当大的障碍。通过采用大剂量的NTG诱变多核单细胞丝状真菌三孢布拉霉JMβ817的孢子,再经紫外线复合照射该孢子制备成的原生质体,使其高产菌株－超黄突变体的隐性基因CarS和CarD得以表达,从中分离到一株CarS隐性突变株JMβ287,β－胡萝卜的产量达到2.36g/l,比出发菌株提高了30％。并通过孢子的亚培养进行定向选育,使高产性状得以稳定遗传,为促进工业化发酵生产天然β－胡萝卜提供了必要的手段。     

赤藓糖醇产生菌B845的形态、生理特征

分离筛选到了一株商赤藓糖醇能力高的菌种B845,通过对B845的形态,生理生化特性试验,发现该菌耐高渗,能发酵葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,细胞为圆形,椭圆形,单边或多边芽殖,有真菌丝,在固体培养基上培养7d后颜色开始变深,由黄色变成褐黑色,参阅真蓝鉴定手册,初步鉴定为圆酵母属菌（Torula sp.)。