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紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。 相似文献
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真菌漆酶异源表达研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物,具有广泛的底物特异性,因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用,解决这个问题的一个主要方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌表达系统中表达的研究结果,着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略。 相似文献
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对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为:液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph(含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph)转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。 相似文献
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抗冷冻蛋白基因遗传转化草菇的研究 总被引:10,自引:0,他引:10
采用RT PCR技术从瑞典的北极云杉卷叶蛾幼虫中扩增出抗冷冻蛋白基因 ,利用基因枪法遗传转化草菇。PCR检测和Southern杂交结果证明 ,抗冷冻蛋白基因已整合进草菇基因组。低温胁迫试验结果表明 ,转基因草菇具有较强的耐低温能力。转基因草菇生物学特性观测结果显示 ,大多数草菇转化子的生长速率明显地慢于对照的宿主菌株 ,多数转化子的菌丝也明显地比宿主菌丝细弱。转化子筛选结果表明 ,采用三轮的转化子筛选程序 ,即第一轮在固体培养基上筛选、第二轮和第三轮在液体培养基中筛选 ,有利于获得真实转化子和淘汰假转化子。转基因草菇一代低温胁迫结果证明 ,转基因草菇后代仍然具有较强的低温耐受能力 ,这说明转基因草菇的耐低温性能在世代之间是稳定的 相似文献
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旨在获得纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌种间融合高产Surfactin的新菌株。以纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌为亲本菌株,通过制备纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体,采用PEG介导的双亲灭活标记法融合原生质体,拟融合子通过PCR鉴定、CPC-BTB法高通量筛选、HPLC复筛以及融合菌株的稳定性验证获得高产Surfactin的新菌株。研究结果表明纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体制备最佳酶解浓度分别为0.25 mg/mL和0.2 mg/mL,最佳酶解时间分别为25 min和20 min,其原生质体得率分别为83.1%和84.3%。两者的原生质体融合条件为:纳豆芽孢杆菌紫外灭活80 min,暹罗芽孢杆菌85℃热灭活40 min,融合体系为50%的PEG6000在38℃下融合时间15 min。获得了遗传稳定的融合菌株F8,该菌株Surfactin产量相对于纳豆芽杆菌提高了33.3%,暹罗芽孢杆菌提高了60%。 相似文献
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银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
银耳(Tremella fuciformis)属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢.银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点.本研究以gpd—Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pG1g—gfp和pG1q—hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg/mL;采用电击法把pG1q—hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为:STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1.0×10^8个/mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2.0kV/cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个/μg DNA.采用最佳电击参数把质粒pG1g—gfP和pG1g—hph按1:1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37.5%.这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达. 相似文献