适于蛹虫草遗传多样性研究的线粒体分子标记的筛选

摘要:【目的】从蛹虫草线粒体DNA中寻找适于遗传多样性研究的分子标记。【方法】通过PCR扩增和序列分析,比较了20个蛹虫草菌株在12个线粒体DNA片段和3个细胞核DNA片段上的序列变异。【结果】蛹虫草在线粒体DNA上的变异水平高于核DNA,主要表现为线粒体基因内含子的插入缺失多样性和较多的碱基变异位点。不同线粒体DNA片段的变异水平也有差异,而且内含子蛋白比外显子编码的蛋白质更易发生氨基酸的改变。增加使用的分子标记数目,其所揭示的遗传多样性程度也在逐渐提高。【结论】我们依 次推荐nad3-cox2、cox2-nad5、cox2、cox3、cob和cox1这6个线粒体DNA位点用于今后蛹虫草遗传多样性或群体遗传结构的分析。     

框内缺失突变法构建变形链球菌comE基因突变株

变形链球菌的种内密度感应系统由com基因家族编码控制。膜受体ComD接受密度感应信号后激活菌体内的反应调节子ComE,ComE作为启动子可以调节一系列相关基因的表达。应用框内缺失突变法（in-frame deletion）,通过两次同源性重组,成功构建了变形链球菌comE基因突变株IFD140ΔcomE。由于框内缺失突变没有引入任何的遗传标记物,所以有效地避免了传统的基因失活方法——插入重复(insertion duplication) 和等位交换(allelic exchange),所导致的下游基因极性效应（polar effect）。经过PCR、测序分析及RT-PCR,证实IFD140ΔcomE仅在comE基因内部缺失了717bp的片段,未引入任何外源性DNA,且comE下游的comD基因可以正常转录,无极性效应产生。对IFD140Δcom表型特征的研究发现,在液体培养基中IFD140Δcom更易发生沉淀性生长和贴壁性生长。菌体呈长链状排列。IFD140ΔcomE的成功构建,为进一步研究变形链球菌种内密度感应系统奠定基础。     

变形链球菌反应调控蛋白ComE结合序列的初步筛选

目的：从变形链球菌基因组中筛选反应调控蛋白ComE结合的核酸序列。方法：⑴提取变形链球菌UA159 基因组,进行超声剪切处理。以基因组片段为模板,用随机引物进行延伸,切胶纯化和PCR 扩增后获得基因组文库。⑵应用基因组 SELEX 技术,以ComE 蛋白为靶物质,与变形链球菌基因组文库共同孵育,循环筛选8轮。筛选产物TA克隆后送去测序,测序结果进行生物信息学分析。⑶将分析得到的2个序列分别克隆入pFW5-luc载体中,然后分别重组到变形链球菌UA159野生株和comE突变株的基因组中,采用RT-PCR的方法检测luc片段的表达。结果：⑴获得了变形链球菌UA159 的基因组文库,片段范围约为100～300bp。⑵随机挑取54个克隆送去测序,经生物信息学分析和RT-PCR初步验证,最终获得1个ComE 蛋白可能的结合序列。结论：采用基因组 SELEX 技术,筛选反应调控蛋白ComE可能的结合序列,并进行了初步验证,为后续进行变形链球菌反应调控蛋白ComE调控机制的研究奠定了基础。     

SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究

目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性。方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SE-LEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析。结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构。结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选。