人间隙连接蛋白 31 相互作用蛋白Annexin Ⅱ的筛选与证实

间隙连接蛋白 31 (connexin31 , Cx31) 是间隙连接蛋白 (connexin) 家族的一员,目前对于 Cx31 的功能及其调节方式知之甚少 . 采用固相多肽合成的方法合成 Cx31 羧基端一个多肽片段 (250~266) ,经 HPLC 纯化后偶联到匙孔血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化、经蛋白质印迹、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为特异性抗 Cx31 的抗体 . 运用制备的抗 Cx31 多克隆抗体免疫沉淀, SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解, Q-TOF 质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,运用抗体 pull-down 实验,筛选到可能相互作用蛋白 annexin Ⅱ,经过免疫共沉淀、细胞免疫共定位等实验证实 annexin Ⅱ与 Cx31 相互作用 .     

缺失型Duchenne/Becker 肌营养不良家系女性携带者及新发突变的确认

应用多重PCR（multiple polymerase reaction／mPCR）技术,联合DMD基因内部及附近11个短串连重复序列（short tandem repeats,STRs）位点连锁分析,对缺失型Duchenne／Beeker肌营养不良（Duchenne／Becker Muscular Dystrophy,DMD／BMD）家系成员进行DMD基因分型,确定家系中女性成员是否携带者,并进行产前诊断。3个家系中的4名缺失型患者,其中2例为新发突变：4位女性成员中,1名为携带者。应用mPCR和11个STRs的连锁分析,能快速、准确、客观判断家系中女性成员是否携带者身份,适于DMD／BMD临床研究机构遗传咨询、基因诊断和产前诊断常规应用。但在mPCR分析过程中,发现45号外显子扩增产物在不同凝胶中电泳迁移率不同。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gels Electrophoresis／PAGE）对mPCR产物分析快速、清晰,但需要注意片段迁移率,以防止分析错误。     

黑斑蛙重盘吸虫的线粒体基因组特征及其系统发育研究

重盘科Diplodiscidae Cohn, 1904复殖吸虫是两栖动物最为常见的寄生虫,形态多样,目前未见基于线粒体基因组的遗传多样性研究。本研究记述并分析了寄生于滇蛙Dianrana pleuraden肠道的重盘科重盘属Diplodiscus Diesing, 1836黑斑蛙重盘吸虫D.nigromaculati的线粒体全基因组序列,为后续开展此类吸虫的遗传结构及遗传多样性研究提供了新的数据。黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组全长14 697 bp(GenBank登录号：MW698822),由22个tRNA基因、12个蛋白编码基因、2个rRNA基因和1个非编码区组成;AT含量(60%)高于GC含量(40%),但AT含量为目前已报道同盘总科Paramphistomoidea Fischoeder, 1901中最低;trnG基因和trnE基因的互换成为同盘总科吸虫线粒体基因组遗传结构的重要特征。基于12个蛋白编码基因的系统发育树支持重盘属隶属于重盘科。本研究中,滇蛙为黑斑蛙重盘吸虫的宿主新记录。     

植被覆盖度对夏季降温效应的影响——以内蒙古为例

随着全球变暖的加剧,区域热环境问题日益凸显,植被的降温作用逐渐得到广泛关注。目前已有的研究多从样地尺度分析不同类型植被的降温效应。而区域尺度的研究多从定性的角度揭示地表温度与植被覆盖的关系,对评估植被的实际降温效应具有一定的局限性。以内蒙古为研究区,以MODIS地表温度数据为基础,采用近邻分析法,将森林、灌丛和草地的MODIS地表温度与相邻5km范围内的低覆盖地表作为对照,分析植被的降温效应以及植被覆盖度对降温效应的影响。从2015年7月地表温度平均值的结果来看,降温度数在蒙东、蒙中和蒙甘区均呈现森林>灌丛>草地。森林的降温范围在0.67-1.03℃,灌丛为0.60-0.95℃,草地为0.47-0.86℃。植被降温度数与植被覆盖度的回归拟合为对数分布,均呈显著正相关（P<0.01）。且在不同的植被覆盖度范围内植被降温效应具有显著差异,植被覆盖度水平较低时（<40%）,植被覆盖度的增加能更显著地降低地表温度。从整体来看,植被覆盖度每增加10%,森林降温0.12-0.39℃;灌丛降温0.1-0.2℃;草地降温0.049-0.075℃。综上,内蒙古作为全球气候变化最为敏感的区域之一,研究植被的夏季降温效应能够为内蒙古的气候调节服务评估提供重要的理论支撑及案例参考。     

增强型肿瘤特异性启动子介导CDTK治疗肝癌的体内外研究

目的:探讨运用增强子上调肿瘤特异性启动子h TERT转录活性后,调控自杀融合基因CDTK对人肝癌细胞系Bel-7402的体内外杀伤作用。方法:将CMV增强子、h TERT启动子及CDTK自杀融合基因克隆入核糖体基因区打靶载体p Hrn,构建p Hr-Ce Tp CDTK-GFP治疗载体并转染Bel-7402细胞,经RT-PCR、HPLC、MTT检测CDTK基因的表达和对肝癌细胞的体外杀伤效果。再将Bel-7402细胞接种到裸鼠皮下致瘤,以肿瘤杀伤载体p Hr-Ce Tp CDTK-GFP进行瘤内转染并检测其抑瘤效果,此外将转染后的细胞接种致瘤,检测其成瘤时间及肿瘤生长曲线等,从两方面检测其体内杀伤效果。结果:成功构建了肿瘤特异性治疗载体,体外转染肝癌细胞后,经RTPCR、HPLC证明CDTK基因能在肝癌中表达,且治疗载体在体外对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现裸鼠致瘤后治疗组血清中5-Fu浓度为7.694μg/ml,治疗组肿瘤体积与对照组相比减小6.5倍。而细胞转染治疗载体后致瘤,治疗组成瘤时间比对照组晚8天,且治疗组裸鼠的平均生存期较对照组延长16天。结论:p Hr-Ce Tp CDTK-GFP载体能在体内外高效靶向杀伤肝癌细胞,为肝癌基因治疗提供了一种新的途径。     

内皮细胞特异性启动子pvWF和pVE的克隆及表达

目的:克隆并验证内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)特异性启动子,为转染人胚胎干细胞(h ESC)后实时监测ECs的定向分化情况以及利用干细胞实施血友病A的基因治疗研究提供基础。方法:通过酶消化法原代分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs),结合RT-PCR和免疫荧光验证分离后的HUVECs表达内皮细胞特异性标志基因血管性血友病因子(v WF)和血管内皮钙粘素(VE-cadherin/CDH5)。抽提HUVECs的g DNA,通过PCR扩增内皮细胞特异性表达基因v WF和VE-cadherin转录起始位点上游不同大小的启动子片段,将其取代报告基因载体p EGFP-N1中的广谱启动子CMV,构建4个质粒,即pv WF-1、pv WF-2、p VE-1、p VE-2,分别转染HUVECs和h ESCs,48 h后观察并比较各启动子片段启动绿色荧光蛋白GFP表达情况,筛选最具特异性及转录活性的启动子片段。结果:通过酶消化法,本研究成功分离出具有典型上皮样细胞的HUVECs。RT-PCR和免疫荧光结果表明HUVECs特异性表达v WF和VE-cadherin。酶切及测序证实所构建的4个含ECs特异性启动子片段的质粒与理论序列相符,通过核转染至HUVECs及h ESCs后,48 h后观察到所克隆的VE-cadherin 2105bp启动子片段具有内皮细胞表达的特异性和较强的转录活性。结论:本研究成功筛选出具有内皮细胞表达特异性及较强转录活性的启动子片段。     

核定位信号肽提高核糖体区打靶载体转染效率的研究

核糖体区打靶载体(10～14 kb)是中南大学医学遗传学国家重点实验室构建的一种具有定点整合能力的非病毒载体,具有安全性好及长期稳定表达的特点,但是较低的转染率成为其应用于临床的主要障碍．核定位信号肽可以促进非病毒载体进入细胞核,从而提高其转染效率．但是核定位信号肽提高外源基因表达的能力却严重受到其与DNA偶联方式及偶联剂的影响．采用偶联剂SPB可以通过静电作用将核糖体区打靶载体与SV40 核定位信号肽有效结合,并且可以防止其被DNase降解．应用聚乙烯亚胺转染人原代皮肤成纤维细胞后,激光共聚焦显微镜观察显示,核定位信号肽可以在60 min内携带12 kb的质粒DNA进入细胞核．转染后48 h,流式细胞仪检测GFP表达,结果显示转染率提高了4～5倍．聚乙烯亚胺是一种毒性小,而且价格低廉的高分子转染试剂,广泛被应用于体内基因治疗的研究中,上述研究将会促进核糖体区打靶载体在临床基因治疗中的应用．     

定位于5q31-5q32的DFNA52的20个候选基因的突变筛查

为了克隆定位于5号染色体微卫星标记D5S2056和D5S638之间约8.8 cM的区间内的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋 DFNA52 (OMIM: 607683)的致病基因, 文章根据基因在耳蜗组织的表达情况, 筛选出20个候选基因, 设计合成了扩增20个基因外显子及外显子与内含子交界的引物, 用DNA直接测序法进行序列变异分析。结果显示, 在基因外显子及侧翼区共发现了45个单核苷酸多态, 其中42个变异在多态数据库已报道, 其余3个为新发现的单核苷酸多态, 序列变异与疾病表型无共分离现象, 排除了这些基因外显子突变导致遗传性耳聋的可能性。     

大肠杆菌基因工程菌诱导表达重组琼胶酶rAga0917的条件优化

琼胶酶可催化长链琼脂糖分子内糖苷键水解产生具有生物活性的琼胶寡糖。琼胶酶具有重要的科研和应用价值,从而对琼胶酶的研究也日益增多。为获得基因工程菌株BL21(DE3)ply Ss-p ET28a(+)-Aga0917重组琼胶酶r Aga0917的高效表达条件,本研究通过单因素实验及正交设计探索了种龄、诱导剂浓度、诱导时机、诱导温度和诱导时间对基因工程菌株表达的r Aga0917酶活力的影响。单因素实验结果显示,种龄6 h、诱导剂终浓度0.05 mmol/L、诱导时机4 h、诱导温度25℃、诱导时间16 h时酶活力最高;正交设计结果显示,r Aga0917的最优表达条件组合为:种龄6 h、诱导时机4 h、诱导剂终浓度0.1 mmol/L、诱导温度16℃。对正交设计结果的直观分析和方差分析结果均表明,四个因素对异源表达目的蛋白琼胶酶酶活力影响的顺序为:诱导时机诱导温度种龄诱导剂终浓度。     

广东永汉传统农村的聚落生态观

生态观作为人类对人与自然关系以及人类生态系统的基本看法,是一种综合了聚落生态、社会、文化、空间等多重属性的研究视角。采用田野调查法,走访了永汉300余个传统农村聚落中的98个,获得由68个聚落个体组成的样本。"后龙山林地+建筑群+地堂+鱼塘+耕地"为这些聚落的基本构成模式。其生态观主要由社会、经济、文化三类因素构成,三者共同影响了聚落选址、规模和结构。社会因素主要包括同一聚落內部以及不同聚落之间的社会关系;经济因素主要包括饮食和居住的生存需求;文化因素的主要内容是风水。改革开放以来聚落发生演替,原因是生态观中经济因素地位大大提高,风水的影响降低,社会结构发生重大改变。演替过程中出现土地浪费等一系列问题,必须发展一种基于传统农村聚落保护及再生的新的生态观及可持续发展模式以修正演替过程中出现的问题。