木聚糖酶EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性分析

[目的]以糖苷水解酶11家族耐热木聚糖酶EvXyn11TS为研究对象,定点突变其编码基因Syxyn11,揭示EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性.[方法]对不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度较高的若干11家族木聚糖酶进行多序列同源比对,发现只有耐热的EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32);运用分子动力学模拟预测该N端二硫键存在与否对木聚糖酶热稳定性的影响.以人工合成的Syxyn11为母本,采用PCR技术将其编码Cys5的密码子TGT突变为编码Thr5的ACT,构建去除了N端二硫键的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M;分别将Syxyn11和Syxyn11M在毕赤酵母GS115中进行表达,并分析表达产物EvXyn 11 TS和EvXyn11M的温度和pH特性.[结果]酶学性质研究结果表明:EvXyn11M的最适温度Topt由突变前的85℃降至70℃;EvXyn11TS在90℃的半衰期t1/290为32 min,而EvXyn11M在70℃的半衰期t1/270仅为8.0 min.[结论]运用分子动力学模拟预测了N端二硫键对EvXyn11TS耐热性的重要作用,并通过定点突变验证之,为其它与耐热EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造提供了新的技术策略.     

案例教学法在肝脏生物化学教学中的应用CSCD

在讲授临床医学专业生物化学课程中"肝的生物转化作用"一节时,我们采用了案例教学法。实施过程分三步走,第一步:首先选取一个典型的酒精性肝损伤临床案例,将三十二名二年级医学生分为四个讨论组,每组安排一名教师,就案例所描述的问题,引导学生进行课堂初步讨论;第二步,要求学生课后以小组形式通过查阅专业文献,在一周时间内,对案例所涉及的知识点进行全面深入的学习,并将学习成果总结成PowerPoint文档;第三步,指导教师从每个学习小组,随机抽选四名学生作为代表将他们的学习成果在课堂上进行汇报展示,每组汇报时间长度为20 min,并有5 min回答问题时间,指导教师和其他组同学对汇报结果进行总结和点评。相较于传统教学方法,案例教学使学生对于抽象、枯燥的非营养物质在肝脏中的生物转化反应有了具象认识,产生了更强的自主学习动力,并使学生认识到所掌握的生物化学知识在解决临床问题中发挥的巨大作用,教学效果更为显著。     

菜豆环氧化物水解酶的表达及其催化特性研究

【背景】光学纯环氧化物及邻二醇是一类多功能手性砌块。与化学合成法相比,环氧化物水解酶(EHs)介导的生物转化法因环境友好而成为当前的研究热点。【目的】从菜豆(Phaseolus vulgaris)中克隆一种EH基因并进行原核表达,研究重组酶催化环氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的水解特性。【方法】通过计算机辅助分析EHs的一级结构,推测一种菜豆来源的未知功能蛋白(PvEH4)可能具有EH活性。利用RT-PCR技术,以菜豆总RNA为模板,扩增编码PvEH4的基因pveh4,并实现其在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达。利用重组菌E.coli/pveh4全细胞催化SO水解,分析PvEH4的对映选择性和区域选择性。【结果】一级结构分析表明,PvEH4具有α/β折叠型EH特有的保守区域。SDS-PAGE结果显示PvEH4的表观分子量为39.4 kD。PvEH4针对SO的对映选择率(E值)为10.1,区域选择性系数αS和βR分别为99.5%和82.5%。当外消旋SO转化率达到68.1%时,可同时获得99.9%ees的(R)-SO和92.3%eep的(R)-苯乙二醇(Phenyl-1,2-ethanediol,PED),两者的产率分别为31.9%和65.6%。【结论】PvEH4的挖掘不仅增加了植物类EHs的数量,同时也为EHs的蛋白分子改造提供参考。     

甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达

为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达,将甾短杆菌Brevibacterium sp．DGCDC-82胆固醇氧化酶基因用PCR的方法去掉信号肽序列,连接到质粒pTrc99a,遗过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组菌JMl09／pTrc99a—COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5．5×10^4的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700U／L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7．5,最适温度为40℃。     

黑曲霉固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶

以黑曲霉WA301为生产菌固态发酵生产酸性β－甘露聚糖酶,较适的培养基组成和培养条件为：麸皮10g,魔芋粉0.4g,豆饼粉1.5g,硫酸铵0.2g,起始湿度55％,pH自然,发酵温度35℃,发酵周期约96h。在此条件下,WA301的酸性β－甘露聚糖酶产率为950U／g干曲左右。     

中温α—淀粉酶性质的研究

本文对Ｂ．Ｓ．７９６所产中温α－淀粉酶的最适反应温度、热稳定性,最适酶反应ｐＨ以及酶的ｐＨ稳定性等进行了系统的研究。同时研究了钙离子对酶稳定性的作用。为该酶在工业上的广泛应用提供了一定的理论基础。     

人IL-29的定点突变及抗肿瘤活性初步分析

为探讨人白细胞介素-29(h IL-29)变异体的抗肿瘤活性,根据h IL-29成熟肽的生物信息学分析数据,采用大引物PCR方法对其肽链第33位赖氨酸、35位精氨酸的编码基因进行定点突变,获得的h IL-29变异体基因构建重组真核表达质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115进行发酵表达,经纯化得到重组人白细胞介素-29变异体蛋白(rh IL-29mut33,35)。经CCK-8法检测抗肿瘤细胞增殖的数据显示,rh IL-29mut33,35对肝癌细胞BEL7402、结肠癌细胞HCT8和胃癌细胞SGC7901的增殖均具有抑制作用,高剂量组对这3种肿瘤细胞的增殖抑制率分别为(30.99±1.58)%、(22.47±1.37)%和(32.05±2.02)%,而且抗增殖作用比野生型rh IL-29的更强(P0.01),表明变异体rh IL-29mut33,35具有潜在的医药开发价值。     

β-甘露聚糖酶末端残基变体对其酶学特性的影响

本研究用宇佐美曲霉Aspergillus usamii的5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A为母本,借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等理性设计方法,将AuMan5A的N-末端和C-末端分别截去3个无规则的氨基酸残基,构建出截短的β-甘露聚糖酶 AuMan5A^N3C3.将AuMan5A和AuMan5A^N3C3的编码基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达,对表达产物进行了初步纯化并分析比较了其酶学特性及各自的表达水平. 结果表明,reAuMan5A和reAuMan5A^N3C3的最适温度Topt均为70 ℃,reAuMan5A^N3C3在60 ℃的半衰期t_1/2⁶⁰为38 min,较reAuMan5A（t_1/2⁶⁰=40 min）略有降低;在相同表达条件下,reAuMan5A^N3C3上清液的β-甘露聚糖酶活性为73.4 U/mL,较reAuMan5A 的52.8 U/mL提高了39.0%;纯化的reAuMan5A^N3C3酶比活性为182.7 U/mg protein,较reAuMan5A的126.3 U/mg protein提高了44.7%. 与reAuMan5A相比,reAuMan5A^N3C3对角豆胶的Km值下降不明显,Vmax值有显著提高.     

木聚糖酶的酶学特性与分子生物学

木聚糖酶是一种重要的工业酶制剂,随着生物技术的不断发展,人们已从多种生物体中分离到大量的不同类型和功能的木聚糖酶。该文就木聚糖酶的酶学性质、基因和基因工程最新研究成果作一综述。     

定点突变改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化特性

环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(Pv EH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对Pv EH1进行改造,以期改善Pv EH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明Pv EH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1~(L105I)和E.coli/pveh1~(V106I)对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高;L105I和V106I位组合突变菌株E.coli/pveh1~(L105I/V106I)的催化活性(493.8U/g湿细胞)是E.coli/pveh1的3.1倍,对映选择性(E=8.3)也提高至E.coli/pveh1的1.5倍。纯化后Pv EH1~(L105I/V106I)的催化活性为17.6U/mg,是Pv EH1的1.5倍,对1a的催化效率提高至Pv EH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白质的可溶性表达量。利用E.coli/pveh1~(L105I/V106I)全细胞催化100mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯(R)-1a(ee96%)的产率和时空产率分别为31.2%和5.12g/(L·h),因此,在手性纯(R)-1a的制备中,E.coli/pveh1~(L105I/V106I)是一种颇具潜力的生物催化剂。