刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

根据已克隆的刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、SE和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化.结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05),三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后SS和bAS的表达量迅速回升,SE无显著变化.SS和bAS在叶片和根中的表达量较高,SE表达量的最大值出现在叶片和幼茎中.刺五加SS、SE和bAS基因的表达间存在显著的正相关关系(P<0.05).研究结果为进一步分析关键酶基因对刺五加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础.     

刺五加幼叶原生质体的分离法

将室内盆栽的刺五加幼苗叶片以含1%纤维素酶和0.5%果胶酶的酶解液酶解6h后,其游离原生质体的产量和活性分别为2.22×105个·g-1(FW)和92.8%,酶解液中加入的渗透压稳定剂——甘露醇浓度以0.5mol·L-1为最适宜。     

鲨烯合酶基因的密码子偏性分析

为了分析鲨烯合酶(squalene synthase, SS)基因密码子的使用方式及其影响因素,利用codon W和SPSS 16.0软件对47条来自不同物种的SS基因进行多元统计分析、对应性分析.SS基因密码子1~3位碱基的GC含量(GC1, GC2和GC3)依次为51.33%、34.65%和54.37%,3个位点的GC含量均呈极显著相关关系(p<0.01),对应性分析的结果表明,第1轴显示30.71%的差异,有效密码子数和GC3、GC1和GC2的均值与GC3之间的相关性均达极显著水平(p<0.01).筛选出的26个最优密码子的第3位碱基均为G或C.以MEGA 5.0构建的基于SS蛋白质序列的进化树比基于RSCU的聚类更符合传统的系统发育观点.SS基因密码子偏好以G/C结尾,使用模式受选择和突变影响,突变对密码子偏好影响较大.     

三萜皂苷的生物合成

异戊烯二磷酸在香叶二磷酸合成酶、法呢二磷酸合成酶、鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶催化下合成2,3-氧化鲨烯,再经氧化鲨烯环化酶催化形成各种三萜类,三萜类经细胞色素P450、糖基转移酶和β-糖苷酶的修饰,形成各种类型的三萜皂苷。     

生物体内的γ-微管蛋白

γ-微管蛋白在真核生物体内以γ-微管蛋白环式复合体和γ-微管蛋白小复合体两种形式存在.γ-微管蛋白在真核生物体内的主要功能是参与微管晶核形成、有丝分裂纺锤体的形成以及细胞周期调控等.该文重点介绍植物体内的γ-微管蛋白所行使的功能.     

刺五加细胞色素P450基因的克隆与表达分析

根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)基因的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全长序列,并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示,克隆了全长为1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列,该基因编码469个氨基酸残基组成的蛋白质。GenBank登录号为KF498590,与人参、三七的P450氨基酸序列一致性分别为91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(萌芽期)的1.26倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.49倍。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶蛋白表达和定位

目的:对刺五加的内生菌青霉属Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,PmSS)进行原核表达和荧光定位。方法:将PmSS基因连接pET-30a(+),转化BL21(DE3)后诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达效果。利用荧光表达载体pDsRed2-N1对PmSS蛋白定位。结果:成功构建了PmSS基因的体外表达载体pET-30a-PmSS,在BL21(DE3)能表达出约60 kDa的蛋白。温度为30℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L时的表达量最高。荧光定位结果显示,PmSS呈点状或面状集中分布于内质网上。结论:获得了PmSS重组蛋白并确定了PmSS的表达部位,为进一步研究P.minioluteum提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

药用植物刺五加染色体核型分析

采用根尖压片技术对刺五加的细胞染色体计数,并对其进行了核型分析,结果表明：刺五加染色体数目为2n=48,染色体基数X=24。其中1对染色体上有随体,核型公式为：K（2n）=48=12m＋18sm（SAT）＋8st＋10t。染色体相对长度组成2n=4L＋22M2＋14M1＋8S,属于“3B”型。全组染色体总长30．82¨m,长臂总长22．88Dm,核型不对称系数为74．23％。     

刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:(1)刺五加MDD基因cDNA序列全长1 769bp(GenBank登录号为JQ905594),开放阅读框全长1 263bp,编码420个氨基酸残基,包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列;刺五加MDD蛋白的二级结构中含有161个α螺旋,占38.33%;68个延伸链,占16.19%;19个β折叠,占4.52%;172个无规则卷曲,占40.95%;刺五加MDD蛋白无跨膜区域,定位于膜外。(2)刺五加MDD基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。在整个生长期中,MDD的表达呈现高-低-高-低的变化趋势,第一个表达高峰出现在萌芽期至叶片完全展开时,第二个高峰出现在果实体积快速增长期,最高表达量(叶片完全展开期)为最低表达量(叶片衰老期)的4.51倍;不同器官中,幼茎的表达量最高,为最低表达量(叶片)的7.22倍,但叶片、叶柄和根中的表达量差异不显著。研究结果为阐明刺五加皂苷的生物合成及对其进行表达调控奠定了基础。     

离体条件下暴马丁香切开种子的萌发

分别以三种催芽处理10、20、40 d的暴马丁香种子进行离体培养试验,对种子做三种切割处理,中间切、两端切和完整种子。结果表明:采用切开种子的方法进行离体培养可提高种子发芽率,中间切种子的萌发最好,且在培养10 d后发芽率即达到最高值;经过40 d催芽处理的种子优于未经催芽和只进行20 d催芽处理的种子;切开种子以MS培养基附加5 mg/L BA或5 mg/LBA+0.1 mg/L IBA为最适培养基。