烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌

目的应用反向线点杂交技术(reverse line blot hybridization,RLB)快速鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌。方法收集我院真菌和真菌病研究中心保存的5种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉)和7种毛霉目真菌(冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉),共计98株菌株。利用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增,用12个真菌种特异性探针与扩增后产物进行反向线点杂交。将RLB结果与真菌传统形态学鉴定结果、ITS区DNA测序结果进行比较。结果 RLB可以正确鉴定98株实验菌株,与形态学方法和ITS区测序方法鉴定结果100%一致,种特异性探针之间未见交叉杂交,显示出该方法的高度敏感性和特异性。8株阴性对照菌株(白念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢、马尔尼菲青霉、疣状瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克银汉霉),使用RLB方法无法鉴定。通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法验证RLB的敏感性为1.8×10-3 ng/μL。结论 RLB技术为实验室早期快速诊断、鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌提供参考。     

鼻眶脑毛霉菌病16例临床病理分析

目的探讨鼻眶脑毛霉菌病(ROCM)的临床与病理特征,提高对该病的认识和病理诊断水平。方法回顾分析首都医科大学附属北京同仁医院1998～2008年16例ROCM患者的病历资料。用HE、PAS和GMS染色显示组织病变特点及真菌的形态特征,对1例石蜡组织行透射电镜观察。结果 14例(87.5%)有基础疾病,2例(12.5%)无特殊病史。死亡5例(31.3%),3例死于ROCM,2例死于原发病。CT示鼻腔鼻窦软组织密度影16例,MRI示眶内(15例)和颅内(5例)异常信号影。真菌培养7例阳性(43.8%)。组织病理:16例均见组织凝固性坏死、真菌性血管炎及肉芽肿,骨质破坏9例,外周神经纤维坏死7例。特殊染色菌丝形态均符合毛霉目真菌;透射电镜见菌丝形态不规则,菌壁电子密度高。结论 ROCM主要见于糖尿病和血液系统恶性肿瘤者,亦见于无基础疾病者。常见致病菌为根霉和毛霉。在病变组织中找到符合毛霉目真菌形态特点的菌丝可确诊。对临床症状、影像学、真菌培养及病理学表现等多方面进行综合分析可明确诊断。     

首次报道中国北方Fonsecaea monophora所致着色芽生菌病1例及其相关实验研究

目的首次报道中国北方1例由Fonsecaea monophora所致着色芽生菌病。方法患者男性,58岁,主因"右腕部皮损伴瘙痒8~9a"就诊。对皮损脓液直接镜检,皮损组织病理检查,真菌培养,并对培养获得菌株进行形态学,分子生物学鉴定等实验室研究。结果脓液直接镜检可见多个圆形、厚壁、棕色硬壳细胞,皮损组织病理表现为慢性肉芽肿样改变,并可见硬壳小体。真菌培养可见暗棕色,橄榄色至黑色菌落生长,生长速度较慢,镜下可见枝孢型和喙枝孢型产孢。ITS区序列分析鉴定为Fonsecaea monophora。依据临床及实验室检查确诊该例为Fonsecaea monophora所致的着色芽生菌病。口服伊曲康唑200mg,1次/d;特比萘芬250mg,1次/d。治疗3个月后,皮损消退痊愈。结论 Fonsecaea monophora感染也可见于我国北方地区的着色芽生菌病患者,而ITS区序列分析是该菌种鉴定的重要手段,伊曲康唑联合特比萘芬治疗本例患者显示较好疗效。     

体外制备和增殖烟曲霉特异性T细胞的研究

目的体外制备和增殖烟曲霉特异性T淋巴细胞。方法从健康志愿者外周抗凝血中分离并体外扩增DC,利用加热灭活的烟曲霉孢子作为抗原,体外共孵育制备烟曲霉孢子负载的DC,进一步将此成熟DC与源自同一个体的去除了DC细胞的外周血细胞共培养,体外诱导并扩增烟曲霉特异性T淋巴细胞。应用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术检测活化T细胞IFN-γ的分泌情况,流式细胞仪检测细胞因子胞内合成情况,并分析功能细胞的类型和比例。结果 ELISPOT分析显示:PBMC+DC+Conidia实验组IFN-γ分泌(87.33±1.33/4.0×105)高于其他对照组,具有统计学意义(P0.05)。细胞因子流式细胞仪分析显示:PBMC+DC+Conidia组中,2.76%的细胞分泌IFN-γ,其中1.61%为CD4+T细胞,与各对照组相比具有统计学意义(P0.05)。获得的烟曲霉特异性T细胞可以在体外可进行大量增殖。结论本文结果显示烟曲霉孢子在体外可以作为变应原诱导产生烟曲霉特异性CD4+T细胞介导的Th1型免疫反应,为未来制备和扩增烟曲霉特异性T细胞及过继免疫治疗侵袭性曲霉病提供实验基础。     

肝脏的真菌感染

随着免疫抑制剂应用的增多,肝脏的真菌感染病例逐渐增加,越来越引起医学界的关注,现对肝脏常见的真菌感染的病因,临床表现,诊断以及治疗作一综述。     

肝移植后播散性隐球菌病1例及其实验研究

目的播散性隐球菌病临床及实验研究。方法患者女,47岁,肝移植术后2 d,面部、肩部、四肢皮肤出现多发溃疡,伴昏迷。通过脑计算机断层扫描、皮损组织病理检查、PAS染色、皮损组织真菌培养及激光俘获显微切割结合PCR扩增序列分析确诊,并对获得菌株进行尿素酶试验、API试验、PCR扩增测序等实验研究。结果皮损组织病理可见大量圆形和椭圆形菌体,PAS染色阳性。血液和脑脊液真菌镜检均为阴性。皮损组织真菌培养可见酵母样菌落生长,菌株尿素酶试验阳性,API试验鉴定为新生隐球菌。ITS区序列分析鉴定为新生隐球菌grub ii变种。激光俘获显微切割结合PCR扩增,序列分析与培养获得的菌株直接PCR扩增后序列分析结果一致。脑脊液特异性隐球菌抗原（＋＋）,血液特异性隐球菌抗原（＋＋＋＋）。脑CT显示为多发结节灶。依据临床及实验室检查确诊为播散性隐球菌病,致病菌为新生隐球菌grubii变种。结论通过对该病例的深入研究,为临床明确诊断播散性隐球菌病奠定基础,确立了显微切割技术在皮肤真菌感染中的应用价值。     

烟曲霉感染的宿主防御机制以及相关免疫学研究进展

随着免疫抑制剂广泛应用和免疫抑制患者的不断增多,由烟曲霉引起的侵袭性感染病例逐渐增加,越来越引起医学界的关注。本文特此对烟曲霉感染的宿主防御机制以及免疫学研究进展作一综述。     

深部念珠菌感染的诊断进展

近年来,真菌感染的发病率和病死率不断上升。念珠菌作为常见的机会性致病真菌,其感染的早期诊断目前存在很多难点。随着人们对念珠菌认识的不断深入和诊断方法的不断进步,深部念珠菌感染的早期诊断在过去几年中取得了很大的发展。现就深部念珠菌感染的诊断进展做一综述。     

宿主抗曲霉菌感染免疫机制的研究进展

随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用,艾滋病、糖尿病等疾病的发病率不断上升,免疫受损患者日益增多,侵袭性曲霉菌感染逐渐增加,并越来越受到关注.阐明曲霉菌感染的发病机制,从而找到有效的治疗手段是基础研究和临床工作者的共同命题.宿主的免疫对于曲霉菌感染的发病机制具有至关重要的作用,掌握宿主对曲霉菌的免疫机制是研究曲霉菌感染的基础,该文就宿主对曲霉菌感染免疫机制的研究进展作一综述.