苏云金芽孢杆菌S1478-1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的Bt菌株S1478-1进行了特性鉴定,研究表明S1478-1分离株菌落形态和生长特征和Bt参照菌株HD73极其相似.16S rDNA序列分析表明,S1478-1分离株与其它B.thuringiensis、B.cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99%.分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130 kD大小的晶体蛋白.生物测定表明S1478-1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50卯值高达5.159 ×108cfu/mL.初步显示S1478-1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株.利用PCR-RFLP方法鉴定S1478-1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3 537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133.3 kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99%同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因.     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bt)产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白.第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3 534 bp,编码蛋白分子量为133 kD,含1 178个氨基酸,等电点为4.84.自此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向.本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用BtCry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解.     

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定.从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1 882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3 924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03%和8.40%.结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900 m至1 400 m的Bt菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带Bt菌株含量最高.显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状.利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20 kD到150 kD不等.进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型.我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性.整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源.     

广西大王岭和大明山自然保护区苏云金芽孢杆菌收集与鉴定

从广西大王岭和大明山两个自然保护区共采集到土样264份,共分离出597株芽孢杆菌,通过光学和电子显微镜检观察,16株分离株观察到伴胞晶体蛋白,初步确定为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),出菌率为6.06%.在16株Bt分离株中,有4株在芽孢形成过程中能产菱形晶体蛋白,其余12株能产圆形和其他形状的晶体蛋白.利用PCR-RFLP方法和SDS-PAGE方法对16株Bt分离菌进行了蛋白和基因型的鉴定,结果表明,16株分离株中含有4株cry1Ac基因,表达约130 kD的晶体蛋白,其中含有cry30基因和cry40基因的菌株分别1株和3株,表达大约75 kD的晶体蛋白;另外8株Bt菌株表达蛋白大小不一,其基因型尚不能确定,有待进一步分析.生物测定表明,产菱形晶体含有cry1Ac基因的4株Bt分离株对鳞翅目小菜夜蛾幼虫有很强的毒杀活性,而其它分离株对小菜夜蛾没有毒杀活性.     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个Bt菌株与分离自广西、黑龙江的5株Bt菌株及2株Bt模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析.19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源bt菌株的质粒多样性.进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性.但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异.研究结果初步证实海南分离株S3078-1是一株无内生质粒的Bt菌株,而S3031-1和S3073-1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株.本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性.     

一株氨氧化细菌的分离鉴定及其氨氧化特性

以城市污水处理工程的好氧活性污泥为菌源,通过富集、分离纯化,筛选出一株自养型氨氧化细菌CM-NRO14,进一步研究了该菌株的系统发育地位及氨氧化特性。根据菌株的形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列测定分析,确定该菌株属于亚硝酸单胞杆菌。CM-NRO14菌株的最大氨氧化速率24.54 mg/(L·d),利用氨的Km值45.66 mg/L,氨自身的抑制常数2401 mg/L,最大氨氧化速率的氨浓度331.2 mg/L。亚硝酸盐对氨氧化的抑制常数1524 mg/L。氨氧化的最适pH 7.79。氨氧化的最适温度34℃。菌株在初始氨氮浓度为180 mg/L,最佳氨氧化pH、温度条件下,4 d内氨氮降解率达到91.6%,菌株倍增时间2.94 d。     

脱氮功能菌去除市政废水中氮素的研究

为了探讨实验室筛选获得的氨氧化细菌CM-NRO14和反硝化细菌CM-NRD3联合去除市政废水中氮素的应用价值,采用了两级A/O工艺进行菌株去除废水中氮素的小试实验,最后将菌株用于废水脱氮工程中。结果表明,脱氮功能菌实现了短程硝化-反硝化,氨氮去除率在98%以上,总氮去除率在75%以上, COD (化学需氧量)去除率大于90%,出水各项指标均低于城镇污水处理厂污染物排放一级(A)标准。脱氮功能菌在去除市政废水中氮素方面有很高的应用价值,可用于城镇污水处理厂提标改造等。     

环氧基高分子磁性复合微球固定化木瓜蛋白酶的研究

研究以甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂,聚乙烯醇(PVA)为分散剂,在Fe3O4磁性纳米粒子存在的条件下,合成了交联度为25%的磁性高分子复合微球(GMAE-DMA).并以这种微球为载体,进行了对木瓜蛋白酶的固定化研究.探讨了最佳的固定化条件如下:温度为25℃,反应时间20h,pH值为8.5,给酶量为160mg/g.同时以酪蛋白为底物,研究了固定化酶的酶学性质,结果表明:固定化酶对不同pH值环境的耐受力、热稳定性和操作稳定性都有较大幅度的提高.实验证明这种高分子磁性复合微球是一种优良的固定化酶载体.     

槟榔烂果病的病原菌鉴定

本研究分别从台湾槟榔病果中分离出病原菌Ar8904、Ar8905;从海南槟榔病果中分离出病原菌Ar8801、Ar8802、Ar8904以及从云南槟榔病果中分离出病原菌Ar8901、Ar892.将这些病原菌进行对比实验.研究结果表明,这7株病原菌在菌株形态、培养形状、寄主范围、致病性以及症状特征都十分的相似.因此,根据炭疽菌现代分类标准,我们可以初步确认台湾、海南、云南的槟榔病果均为同一种炭疽菌引起的.     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

的报道.本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展.