单核细胞增生李斯特氏菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌fimY的快速检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌prfA和hlyA基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以单核细胞增生李斯特氏菌等61株参考菌株做特异性试验;单核细胞增生李斯特氏菌菌株稀释成不同梯度,进行灵敏度试验。试验结果表明该方法具有很好的特异性,灵敏度较高,检测低限可达到为181CFU/ml。可以快速、准确检测单核细胞增生李斯特氏菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。     

PstS和PstB调控无机磷酸盐转运和介导细菌耐药的机制

无机磷酸盐(Pi)在菌体遗传、能量代谢及细胞内的信号传导等生物过程中发挥重要的作用。在细菌中,主要由磷酸盐特殊转运系统(Pst)和磷酸盐转运系统(Pit)来完成对Pi的吸收和利用。其中,Pst是在低磷胁迫下转运Pi的关键系统。近年来的研究表明,Pst系统除在调控Pi的代谢和平衡中发挥重要作用外,还介导细菌耐药、产毒和侵袭等。Pst系统是ABC转运蛋白家族的一种,一般由PstS、PstC、PstA、PstB和PhoU5个蛋白组成。其中,PstS和PstB蛋白是该系统中的关键蛋白。本文重点对PstS和PstB调控Pi转运和介导细菌耐药的分子机制进行综述,旨在为深入研究该系统与细菌耐药的关系,以及研发以PstS和PstB为靶点的新药提供参考。     

大黄素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制

以金黄色葡萄球菌为供试菌,通过测定大黄素对其细胞膜的通透性、可溶性蛋白质和呼吸代谢的影响,来阐述大黄素的抑菌作用机制. 利用电导率、生物大分子分析、呼吸代谢抑制检测等方法,验证大黄素的药效作用. 实验结果显示,大黄素作用金黄色葡萄球菌后,培养基溶液中电导率比对照组增加了2.23%,DNA和RNA大分子的含量比对照组增加了67.36%,大黄素作用金黄色葡萄球菌16 h后,菌体可溶性蛋白总量比对照组减少了28.3%;大黄素能抑制金黄色葡萄球菌物质代谢中的2种关键酶的活性,其中琥珀酸脱氢酶活性抑制率为53.8%,苹果酸脱氢酶的活性抑制率为25.5%.上述结果表明,大黄素可以破坏细菌细胞膜的通透性,抑制菌体内的蛋白质合成,通过抑制代谢关键酶的活性发挥杀菌作用.     

染料木素对MRSA外排蛋白表达的影响

[目的] 研究染料木素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）外排蛋白的影响。[方法] 通过联合药敏实验检测染料木素影响MRSA对环丙沙星的敏感性;利用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（iTRAQ）技术,检测染料木素作用MRSA41577后菌体蛋白表达量的变化;通过生物信息学方法对差异显著的蛋白进行系统分析;通过qPCR和尼罗红外排实验,探讨耐药相关的蛋白介导细菌耐药的作用机制。[结果] 联合药敏实验结果显示,染料木素能增强MRSA对环丙沙星的敏感性;通过iTRAQ技术检测到差异显著蛋白共有129个,包括60个表达上调的蛋白和69个表达下调的蛋白;生物信息学分析结果显示,与细菌耐药相关的蛋白约有14个,其中,通过主动外排系统介导细菌耐药的蛋白主要有PstB、PstS等;qPCR结果显示,与对照组相比,PstB、PstS的基因表达量分别下降了51.6%和78.6%;尼罗红外排实验结果显示,染料木素与尼罗红之间存在竞争关系,为MRSA41577的竞争性抑制剂。[结论] 染料木素可通过降低MRSA41577外排基因pstB和pstS的mRNA表达量,进而影响PstB、PstS外排蛋白的表达来逆转细菌耐药;此外,染料木素还是MRSA41577的竞争性外排抑制剂,可通过与底物竞争外排的方式,使抗菌药物留在菌体内发挥抗菌作用。     

木犀草素通过调节凝血活性物质及凝血因子含量维持机体血液循环功能的稳定

目的探讨木犀草素通过调节凝血活性物质及凝血因子含量维持机体血液循环功能的作用机制。方法采用试剂盒和试管法测定木犀草素作用后的凝血酶原时间和血浆复钙时间;采用酶联免疫吸附法检测木犀草素对血液凝血活性物质血栓素(TXB2)、纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)、促红细胞生成素(EPO)和凝血因子Ⅶ(FⅦ)、凝血因子Ⅸ(FⅨ)含量的影响;采用PCR法测定木犀草素对凝血因子Ⅶ、Ⅸ的基因表达情况。结果木犀草素能缩短凝血酶原时间和血浆复钙时间,与对照组相比,40 mg/kg的木犀草素使凝血酶原时间和血浆复钙时间分别降低62.89%和64.05%(t=8.713 6、6.218 1,均P0.000 1),表明木犀草素能够促进机体的凝血功能,从而调节血液循环。酶联免疫结果显示,木犀草素能提高小鼠凝血活性物质TXB2、PAI-1和EPO的含量,与对照组相比,40 mg/kg木犀草素能使其含量分别提高11.94%(t=-7.638 0,P=0.000 3)、80.75%(t=-21.698 4,P0.000 1)和26.15%(t=-9.610 4,P=0.000 2),表明木犀草素可通过促进血小板的凝集、纤维酶原的活化以及增加血液的黏度来维持机体血液循环功能的稳定。木犀草素也能提高凝血因子Ⅶ和Ⅸ的含量及其基因表达量,与对照组相比,40 mg/kg的木犀草素能使凝血因子Ⅶ和Ⅸ的含量分别提高290.86%(t=-16.369 1,P=0.000 1)和374.52%(t=-8.104 2,P=0.001 2),基因表达量分别提高172.73%和224.63%(t=-22.007 5、-31.198 6,均P0.000 1),表明木犀草素可通过调节凝血因子Ⅶ和Ⅸ的表达量促进机体凝血,维持机体血液循环功能的稳定。结论木犀草素具有维持机体血液循环功能稳定的作用,其作用机制是通过提高凝血活性物质的含量,调节凝血因子的基因表达量,提高凝血因子的含量,以及抑制纤维酶原的激活和增加血液的黏度等多方面综合作用来实现的。     

大豆异黄酮糖苷酶的纯化及性质研究

利用Absidiasp.R菌株,通过液体发酵的方法,得到了一种高活性的大豆异黄酮糖基水解酶。该酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellocuse(DE-52)离子交换层析纯化,被纯化了11倍,收率为10.9%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量为53kD;该酶的最适反应温度为50℃;最适pH为5.0;温度低于60℃,pH在5.0~7.0范围内该酶较稳定,Co2 、Ca2 对该酶有激活作用;Ag 、Cu2 对该酶有抑制作用。当以染料木甙为底物时该酶的米氏常数(Km)为1.3×10-2mol/L。等电聚焦电泳测得其等电点为3.2。     

和厚朴酚抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜形成

【目的】研究和厚朴酚(HNK)抑制MRSA生物被膜(BF)形成的作用机制。【方法】使用TTC法测定了HNK对供试菌株BF的形成和成熟BF的抑制作用;刚果红平板法定性检测了HNK对PIA合成的影响;分光光度法测定了HNK对供试菌株eDNA释放量的影响;RT-PCR技术检测了HNK对供试菌株icaA、cidA以及agrA基因表达量的影响。【结果】HNK对MRSA 41573 BF的形成和成熟BF均有较强的抑制作用,其中,HNK抑制MRSA 41573 BF形成的MIC和MBC分别为10μg/mL和20μg/mL;抑制成熟BF的MIC和MBC分别为50μg/mL和100μg/mL。当用亚抑菌浓度的HNK与万古霉素联合作用后,可显著提高成熟BF对万古霉素的敏感性。HNK能显著抑制PIA的合成,且呈浓度剂量依赖。HNK能抑制供试菌株eDNA的释放量,其中1/8 MIC的HNK作用供试菌株16 h后,与对照组相比,e DNA的释放量降低了28.3%。HNK可抑制供试菌株BF形成的相关基因,其中1/2 MIC的HNK作用供试菌株16 h后,与对照相比,icaA的表达量降低了59.1%,cidA的表达量降低了56%,agrA的表达量降低了72.3%。【结论】HNK能显著抑制MRSA 41573 BF的形成,其作用机制主要是通过抑制icaA和cidA基因表达量,影响PIA和eDNA的合成,进而抑制BF的形成。此外HNK也可通过调控细菌的QS系统影响BF的形成。     

细菌的β—1,4—内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母（Saccharomyces cerevi…

将大肠杆菌质粒ｐＡ２含气单胞菌的β－１,４－内切葡聚糖酶基因直接连于大肠杆菌／酵母菌穿梭载体ｐＶＣ７２７组建成重组质粒,质粒ｐＶＣ含强启动子。首先,通过菌落染色方法和Ｃｏｎｇｏ－Ｒｅｄ染色方法筛选到大肠杆菌ＤＨ５α转化子,然后以重组质粒转化酿酒酵母ＢＪ１９９１并得到表达。最后,对酶反应的最适ｐＨ和适宜温度进行了测定。     

噬菌体脱毒机理的研究Ⅰ

用噬菌体处理河流弧菌Ⅱ的时间不同,细菌菌落的透明度和超微结构也不一样。在吸附后７ｈ开始菌落出现透明度的变化,首先是不透明（乳黄色）的菌落占绝对优势,但已出现半透明和透明菌落,培养到４８ｈ时,几乎全部变为透明菌落。透明菌落不再能与其噬菌体吸附而产生噬斑,也不会再感染鲍而产生脓疱病。透射电镜观察发现,透明菌落的菌细胞形状和结构大都发生变化。细胞壁薄,细胞质浓缩集中在细胞的一侧或一端。不透明菌落细胞形状正常,细胞壁完整,细胞质外延使细胞横切面呈指环状。电镜观察不同时间取样发现,１号样品细胞结构无明显变化。２号样品多数细胞产生外膜泡。３号样品许多细胞结构与１号相似,但在一些细胞的附近出现成簇的外膜泡和噬菌体。４号样品细胞结构变化较大,细菌的核区被破坏,在细胞的周围发现许多噬菌体。５号样中发现许多菌细胞被破坏,也在一些细胞内发现噬菌体。６号样中透明菌落和不透明菌落细胞结构变化明显。７号样几乎所有菌落都变为透明状,许多细胞破裂等。     

高产大豆异黄酮糖苷水解酶菌株的发酵工艺研究*

Absidia sp．R是从酒曲中分离出的一株产大豆异黄酮糖苷水解酶活性较高的菌株。该菌最佳产酶条件为：2．5％的麦麸为碳源,1％的硝酸钠为氮源,培养基起始pH为7．0,瓶装量为40mL/250mL,接种量8％,培养温度为30℃,转数为160r／min,培养时间为84h,其酶活力可达到82U／mL。除Cu^2 对该菌产酶有较强的抑制作用外,金属离子对产酶影响不大。