BmNPV和AcNPV扩大寄主域杂交重组病毒表达载体的构建和改进

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, 简称AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, 简称BmNPV)表达系统是目前最主要的两类昆虫杆状病毒表达系统. 两者各具特点, 前者寄主昆虫个体较小, 但寄主范围广、适合较大规模的细胞悬浮培养生产体系; 而后者虽然寄主专一, 但以个体较大、易饲养的家蚕为寄主, 具有表达量高、 特别适合产业化水平开发的要求. 为了利用AcNPV和BmNPV各自的优势, 扩大昆虫杆状病毒的寄主范围, 以BmNPV为基础, 利用决定病毒寄主范围的DNA解旋酶基因及同源重组原理, 构建了介于BmNPV和AcNPV间的杂交重组病毒(hybrid baculovirus of AcNPV and BmNPV, 简称HyNPV). 这样构建的杂交重组病毒具有AcNPV和BmNPV的双重优点, 既能感染所有AcNPV的寄主, 又可以在家蚕中表达. 以人碱性成纤维细胞成长因子基因作为应用实例, 克隆构建了这样的一种重组杂交病毒, 可在Sf21, Tn-5, BmN培养细胞及家蚕个体中穿梭表达. 为了减少表达后重组蛋白的降解, 利用“基因敲除”法删除了杆状病毒本身的一种主要蛋白酶-半胱氨酸蛋白酶基因, 提高了重组蛋白的稳定性和表达效率.     

根癌农杆菌致病基因及其生物学功能分析

用转座子标签技术克隆了位于农杆菌（A-208株）染色体上的致病基因acvB、abvA、chvA简单介绍克隆技术的研究思路和策略。染色体基因是农杆菌吸附到植物细胞表面所必需的基因,当某一基因发生突变时,就不能完成贴壁反应而失去毒性。由于转座子Tn5的插入,导致染色体毒性基因失活,最终使农杆菌感染后的受体细胞不能致瘤。用实验证据阐述各基因在T-DNA形成、转移、整合、表达等过程中担负的重要作用。对延宕至今的T-DNA穿壁问题作了推测：植物细胞壁表面可能存有T-DNA的天然穿壁孔道。     

家蚕性别及其决定基因的研究进展

家蚕作为模式生物和鳞翅目昆虫的典型代表,性别决定的分子机制是近年来的研究热点,其分子机制的阐明将为家蚕的雄蚕饲养和害虫的生物防治打下基础.主要对国内外家蚕性别决定、性染色体、家蚕性别决定基因的研究进展进行了综述,并对家蚕性别调控研究中存在的问题进行了分析和展望.     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE21的克隆、表达分析及亚细胞定位

信号失活是嗅觉动态过程的一个重要步骤, 这一过程涉及多样的气味降解酶类。本研究利用RT-PCR方法从家蚕Bombyx mori雄蛾的触角中克隆了一个细胞色素P450基因CYP6AE21。该基因含有一个1 572 bp的开放阅读框（open reading frame, ORF）, 编码523个氨基酸, 预测分子量为60.5 kD, 等电点为8.4, 含有细胞色素P450的特征序列血红素结合位点区域。CYP6AE21和CYP6AE2基因一样在相同位置含有1个内含子序列, 且相应的2个外显子大小相同。两者的核苷酸序列相似性达到94.5%, 且在基因组上以头尾相连的方式成簇排列, 中间由约7.6 kb核苷酸序列隔开。CYP6AE21在幼虫的头部和脂肪体, 以及雄蛾和雌蛾的触角中表达量较高; 在幼虫的其他组织和蛾的多个组织中也有一定的表达。P450酶系的重要组分之一--NADPH细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase, CPR）基因也在雌蛾和雄蛾触角中高水平表达, 而在其他组织中表达量相对较低。亚细胞定位分析表明CYP6AE21表达产物定位于细胞质中。推测CYP6AE21和CYP6AE2是由其中一个基因加倍复制形成的; 此P450的功能之一可能是参与内化进细胞的气味分子的降解清除。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6的克隆、序列分析和组织表达

本文利用RT-PCR和RACE方法,获得了家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（serpin）的开放读码框(ORF) 和5′UTR序列。根据该基因与其他昆虫serpin的同源性关系将其命名为家蚕serpin-6 基因,GenBank登录号EU159447。为了研究serpin-6与家蚕免疫反应的相关机理,对serpin-6基因的组织表达和免疫刺激反应进行了研究。结果表明该基因在家蚕的头部和生殖腺中mRNA表达量非常高,在中肠,脂肪体,丝腺和血淋巴表达量较低。用脂多糖(LPS) 刺激5龄第3 d家蚕后,serpin-6基因在脂肪体和血淋巴中都被显著诱导表达,且都在刺激6 h后表达量最高。推测该基因在家蚕细胞免疫反应中起着一定的作用。     

利用宿主范围扩大的杂交病毒HyNPV在家蚕中表达对虾白斑综合症病毒VP19基因

对虾白斑综合症其病原是对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,简称WSSV）。 VP19是 WSSV的一个囊膜蛋白,HyNPV（Hybrid of AcNPV and BmNPV,简称HyNPV）是BmNPV和AcNPV通过基因重组后得到的一个具有BmNPV和AcNPV双重优点的新型杂交病毒,在克隆了VP19基因的基础上,成功构建了重组转移载体pBlueBicHisC-vp19和重组杆状病毒 HyNPV-VP19。用重组病毒注射接种5龄起蚕,经SDS-PAGE 和Western blotting分析,结果表明,WSSV-VP19基因在家蚕体内得到了表达,特异性条带大小与预计的基本一致,约为21kD。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员.本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyx mori serpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础.首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经...     

家蚕蛾触角蛋白的双向电泳分析

为探讨家蚕Bombyx mori蛾触角发生发育、结构与功能的分子基础和调控机制, 我们采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)技术初步探讨了家蚕蛾触角蛋白及其雌雄表达差异。采用ImageMast 6.0软件分析电泳图谱, 在家蚕蛾触角中检测到约550个蛋白点, 主要集中在分子量14～70 kD, 等电点4～8之间。从雌雄蛾触角电泳图谱中分别检测到419和489个蛋白点, 其中雌雄匹配蛋白点有326对, 匹配率为71.81%。雌雄间表达差异点有34个, 雌雄分别所特有的特异蛋白点分别为9和20个。对特异和差异点进行MALDI-TOF/MS鉴定获得其中5种蛋白--成虫原基生长因子(imaginal disk growth factor)、表皮蛋白RR-1基序15(cuticular protein RR-1 motif 15)、硫醇过氧化还原酶(thiol peroxiredoxin)、空泡ATP酶B亚基(vacuolar ATPase B subunit)以及gasp前体(gasp precursor), 它们在雄蛾触角中表达量都比雌蛾高。这为家蚕触角蛋白的进一步研究提供了基本信息。