病死猪堆肥高温降解菌的筛选、鉴定及堆肥效果

摘要:【目的】为分离得到高温高效降解菌,加快病死猪的降解。【方法】本研究通过稀释平板法和选择培养基初筛及酶活性复筛的方法,从锯末和病死猪(粉碎)好氧堆肥样品中筛选获得两株能分别高效降解蛋白质和脂肪的高温菌株N-3和Y-3。通过16S rDNA对两菌株进行鉴定,并采用L9(34)正交设计对菌株培养条件进行优化。再利用10 L全自动发酵罐按优化后的培养条件对两菌进行发酵生产(菌数达到108CFU /mL)并等体积混合制备成液体菌剂,分别按发酵物料湿重的0%、0.3%、0.6%、0.9%接种至锯末+病死猪(粉碎)堆肥中进行堆肥效果验证。【结果】共分离得到两株高效降解菌,N-3为芽孢杆菌(Bacillus aestuarii),可高效降解蛋白质,其最适生长温度55 ℃,pH为7.2,转速200 r/min,通气量4 L/min;Y-3为嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans),能高效降解脂肪,其最适生长温度60 ℃,pH为7.2,转速300 r/min,通气量3 L/min。堆肥过程中对照组和接菌各组(0.3%、0.6%、0.9%)最高温度分别为58.3、69.0、68.9、66.3 ℃,各接菌组间无显著差异(P＞0.05),但均极显著高于对照组(P＜0.01),且各接菌组堆肥温度达到60 ℃以上天数分别为8、10、9 d,极显著高于对照组的0 d(P＜0.01)。至堆肥结束时,对照组和接菌各组的病死猪降解率分别为71.2%、75.7%、96.7%、97.1%。接菌各组(0.3% 接菌组除外)病死猪降解率均极显著高于对照组(P＜0.01),0.3%接菌组与对照组间无显著差异(P＞ 0.05)。【结论】筛选获得的高温腐熟菌N-3和Y-3为能高效降解蛋白质和脂肪的高温菌株,可以用于病死猪腐熟堆肥,且两菌等体积混合后按0.6% 添加量接种至病死猪堆肥中,能提高堆肥温度,维持高温时间,加快病死猪的降解,从而有效杀灭病原微生物,达到无害化要求。     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

抑氨菌筛选鉴定、培养条件优化及在鸡粪除臭中的应用

目的筛选能抑制鸡粪中恶臭气体NH3释放的亚硝化、硝化细菌菌株。方法以亚硝化、硝化细菌培养基为筛选培养基筛选菌株,然后将菌株分别以10%(v/m,下同)的接种量接种到鸡粪中,测定其对鸡粪中NH3释放量的影响,从中筛选出可减少NH3释放的菌株。根据菌株的形态特征和16S rDNA序列分析对其进行鉴定。通过自动发酵系统对菌株培养温度、pH、通气量及转速四个因素进行正交优化。结果通过筛选得到两株细菌YF1和YS2,经鉴定分别为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)。菌株YF1最适培养条件为温度28℃,pH 7.0,通气量5 L/min,转速200 r/min;菌株YS2最适培养条件为温度30℃,pH6.5,通气量5 L/min,转速300 r/min。温度、pH、接种量和通气量对YF1、YS2影响均极显著(P0.01)。YF1和YS2单独按10%剂量接种分别使鸡粪中NH3的释放量降低26.0%和28.4%,而两菌1∶1混合接种可使NH3释放量降低75.6%。结论 YF1和YS2是抑制鸡粪中NH3释放的优良菌株。     

T-2毒素对于猪肝细胞毒性的分子机制研究

为了探讨T-2毒素对于家畜的毒性机理及诱导凋亡的分子机制,用T-2毒素对猪的肝脏细胞进行暴露,暴露浓度分别为0、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L,暴露时间为48h,然后用微阵列技术检测0.05mg/L处理组基因表达谱的变化。结果表明,氧化应激和细胞凋亡相关基因发生上调,药物和脂质代谢的基因发生下调,同时荧光定量PCR对细胞色素P450家族的CYP2D25和CYP51两个药物代谢基因的表达情况进行了进一步的验证。结果表明,T-2毒素对猪肝细胞的毒性机制可能是引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径氧化应激,进而导致细胞凋亡。     

山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

从山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA,经BamHI部分酶切得到50kb～800kb的DNA片段后,将其连接到pCCIBAC载体上,转化E．coliEPI300,建立山羊瘤胃微生物BAC文库。经RFLP鉴定分析,该文库12672个克隆,平均插入片段为6lkb。该文库的构建为后续新型基因的筛选提供了材料,为进一步研究山羊瘤胃微生物奠定了基础。     

N+注入诱变选育菜粕硫苷降解菌的研究

为选育能够高效降解菜粕硫苷( Glucosinolates,Gls)的菌株,利用能降解硫苷的益生菌黑曲霉CICC-2238进行N+注入诱变.经过两次N+注入诱变,在诱变能量为20 keV,剂量为60 ×2.5×1013ions/cm2时,筛选到一株高效降解Gls的菌株H-109.与出发菌相比较,其Gls的降解率由28....     

鸡IL-2/NDV-F蛋白抗原表位融合基因的表达及免疫性初探

研究鸡白细胞介素-2(chicken interleukin-2,ChIL-2)的免疫佐剂功能,构建ChIL-2与新城疫病毒F蛋白多抗原表位(NDV-F)的嵌合基因,以对鸡新城疫疫病进行防治。采用重叠延伸PCR方法通过基因柔性接头将ChIL-2基因和NDV-F多抗原表位基因构建成ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因并克隆入PET-32a载体,经测序鉴定后,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His融合蛋白,Ni2~+亲和柱纯化,表达产物经SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA检测和鉴定。结果表明,实验成功构建并克隆了ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因,嵌合基因在大肠杆菌中表达的ChIL-2-linker-NDV-F融合蛋白分子量约为48kD,表达量约占菌体蛋白总量的45%,纯化后的ChIL-2-linker-NDV-F融合蛋白能与感染NDV的鸡血清发生反应。上述结果证明ChIL-2-linker-NDV-F嵌合基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有较强的特异性和免疫原性。     

地衣芽孢杆菌D-1产碱性蛋白酶培养条件的优化

为了对产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌D-1的培养条件进行优化,利用10 L发酵罐,采用正交设计19(34)试验,对培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4条件进行优化,得到地衣芽孢杆菌D-1发酵产碱性蛋白酶的最优培养条件为:培养温度37.0℃,pH值7.5,通气量4L/min,搅拌转速300r/min.利用最优条件组合进行验证...     

一株产碱性蛋白酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用初探

为了筛选碱性蛋白酶产生菌并探讨其对蛋白质饲料的发酵效果,以肉粉厂表层土壤为菌株分离源,利用脱脂牛奶培养基分离和纯化蛋白酶产生菌,通过形态特征、生理生化和16S rRNA基因序列分析确定菌株的分类地位,并采用L9(33)正交设计研究筛选出的优势菌种的接种量(3％、6％和12％)、种子液培养时间(12 h、24h和48 h...     

一种直接用于PCR扩增的山羊瘤胃微生物DNA提取方法的建立

目的建立提取高质量的瘤胃微生物DNA的方法,为采用免培养技术研究山羊瘤胃微生物奠定基础。方法采集山羊瘤胃内容物,用SDS高盐法提取微生物总DNA,以通用引物扩增细菌和古细菌的16SrDNA。结果提取到的瘤胃微生物总DNA片段大于23kb,PCR能够扩增出细菌和古细菌的16SrDNA片段。结论用该提取方法得到的山羊瘤胃微生物总DNA能够满足后续实验的需要。