毕赤酵母表达Q8008发酵条件的优化研究

目的对表达巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件,以获得重组textilinin-1(Q8008)最高表达量。方法通过多因素正交实验确定Q8008发酵培养的最适发酵条件。结果表达温度在22℃,pH值为7.0,加入甲醇量为5g/L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84~108h。结论优化巴斯德毕赤酵母的发酵条件,可提高Q8008表达量,为开发抗纤溶酶止血药应用于临床具有重要意义。     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.     

巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichiapastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZaA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33。筛选鉴定转化子．经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33．0 kDa．免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化．发酵罐的表达量达到25000Ku／L发酵液。从每升发酵液中可纯化出11．0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建．为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。     

定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达

目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.     

重组定点突变巴曲酶酶学性质研究

目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6．5～7．5之间。该酶在50℃以下活力保持90％以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活。Ca^2＋和Na^＋离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg^2＋、K^＋、Mn^2＋离子则表现为激活作用,Zn^2、＋Cu^2＋、Fe^2＋、Co^＋离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响。     

纤溶酶抑制剂textilinin-1在毕氏酵母的表达及应用

目的研究真核表达的textilinin-1蛋白纯化品对纤溶酶抑制作用。方法根据textilinin-1的天然氨基酸序列,按照毕氏酵母偏好密码子进行优化,合成textilinin-1基因,重组到pPICZα载体上,并转化至Pichia p.X-33菌种中,实现高效分泌表达,并进行重组textilinin-1活力单位的定义及小鼠断尾试验。结果通过高密度发酵及两步柱层析纯化,最终从10L发酵液中得到6g纯度达97.0%以上的重组textilinin-1。活性研究表明,重组textilinin-1对纤溶酶的活性具有抑制作用,并对tPA所致的小鼠出血倾向有一定的抑制作用。结论重组textilinin-1可抑制纤溶酶活性,并对纤溶性出血小鼠模型有止血作用,具有开发为止血药的潜力。     

重组textlinin-1抑制活性的性质研究

目的对毕赤酵母表达的textlinin-1(Q8008)进行分离纯化,并对其抑制plasmin活性的性质进行研究。方法构建表达Q8008pachia pastoris工程菌,经发酵、纯化得到纯度达95%以上的Q8008。考察不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对Q8008抑制plasmin活性的影响。结果 Q8008在中性条件下比较稳定,其最适pH值为7.0,最适温度为40℃,在30~50℃相对酶活力在90.0%以上;有2个金属离子对Q8008活性测定方法的影响产生了显著性差异,Zn2+起激活作用,Co2+起抑制作用,其余金属离子均无显著性差异。结论 Q8008在中性pH下抑制活性稳定;在50℃以下,受温度变化影响较小;金属离子对其抑制活性测定有一定影响。     

重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.     

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃,pH值为7．0,加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。