定点突变改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化特性

环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(Pv EH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对Pv EH1进行改造,以期改善Pv EH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明Pv EH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1~(L105I)和E.coli/pveh1~(V106I)对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高;L105I和V106I位组合突变菌株E.coli/pveh1~(L105I/V106I)的催化活性(493.8U/g湿细胞)是E.coli/pveh1的3.1倍,对映选择性(E=8.3)也提高至E.coli/pveh1的1.5倍。纯化后Pv EH1~(L105I/V106I)的催化活性为17.6U/mg,是Pv EH1的1.5倍,对1a的催化效率提高至Pv EH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白质的可溶性表达量。利用E.coli/pveh1~(L105I/V106I)全细胞催化100mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯(R)-1a(ee96%)的产率和时空产率分别为31.2%和5.12g/(L·h),因此,在手性纯(R)-1a的制备中,E.coli/pveh1~(L105I/V106I)是一种颇具潜力的生物催化剂。     

超顺磁氧化铁纳米探针用于磁共振分子成像的研究进展

分子影像学是近年来分子生物学和影像学相结合而形成的新型交叉学科,磁共振分子成像技术是分子影像学的重要手段之一,为临床医学诊断提供重要依据。但是由于不同组织之间的弛豫时间相互重叠等问题,导致较小的病变难以显示,磁共振造影剂能提高对软组织的分辨率,其中超顺磁性氧化铁纳米探针作为近年来发展起来的一种新型磁共振分子造影剂。由于具有敏感性、安全性、大的比表面积、高稳定性、靶向性等优点,近年来已成为国内外研究的热点之一。本文就超顺磁性氧化铁纳米探针的增强原理、制备工艺及靶向作用做一综述,以期为该技术的应用与研究提供借鉴和启示。     

花苜蓿抗旱耐盐EST-SSR标记筛选

为了给花苜蓿（Medicago ruthenica Trautv.）抗旱耐盐的生态适应性研究提供特异的遗传标记,在已公布的70对鹰嘴豆抗旱耐盐EST-SSR标记中筛选出稳定性好、多态性高的8对引物,并用这8对引物对挑选出的11个居群的286个个体进行扩增,获得111个等位基因。平均等位基因数为13.88;平均观察杂合度为0.497;平均预期杂合度为0.687;多态信息含量从0.313到0.883不等,平均值为0.649。以上结果表明,筛选出来的8个EST-SSR标记可以用于花苜蓿的遗传多样性分析,而且遗传多样性处于较高水平。多态性丰富的EST-SSR 引物适用于花苜蓿生态适应性进化分析,对揭示花苜蓿抗旱耐盐基因型的遗传变异和地理分布格局以及探讨花苜蓿抗旱耐盐的适应性分化机制有重要意义。     

置换β-甘露聚糖酶底物结合槽内环结构序列改善其酶学特性

位于酶分子活性位点(又称活性中心)附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过同源建模、分子对接及多序列比对,发现位于Au Man5A底物结合凹槽侧壁的一段环结构可能对酶的功能有影响.为证明该假说,本研究采用Au Man5A为母本,利用PCR技术将其底物结合槽内的7肽环结构316KSPDGGN322替换成与两种木霉属β-甘露聚糖酶对应的8肽片段AQSNSDPY,构建了杂合酶基因Auman5ALoop,并在毕赤酵母GS115中进行表达,经纯化获得了杂合β-甘露聚糖酶Au Man5ALoop.酶学特性分析结果显示,与原酶Au Man5A比较,Au Man5ALoop的最适反应p H由3.5~4.0扩宽至3.5~5.5;最适反应温度由65℃提高至70℃;以角豆胶为底物,测得Au Man5ALoop的比活性由351.2 U/mg提高至2 089.2 U/mg.利用双倒数作图法测得动力学常数揭示,Au Man5ALoop的Km值较Au Man5A降低了36%,而kcat值是Au Man5A的6.8倍;同时,Au Man5ALoop的催化效率(kcat/Km)提高了10.7倍.我们的结果说明,通过替换Au Man5A底物结合槽内环结构,可明显改进其酶学特性.我们的结果还提示,活性位点附近的环结构对β-甘露聚糖酶的酶学特性具有重要影响.     

β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析

【目的】为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(~(316)KSPDGGN~(322))组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp~(320)的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af~(D320G)。【方法】采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af)中编码Asp~(320)的密码子GAC突变为Gly~(320)的GGT,构建出突变体基因Auman5A/Af~(D320G),并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af~(D320G)的酶学性质。【结果】AuMan5A/Af~(D320G)的最适温度T_(opt)为70.0℃,变性温度T_m为71.5℃,介于AuMan5A(T_(opt)=65.0℃,T_m=64.5℃)和AuMan5A/Af(T_(opt)=75.0℃,T_m=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(k_(cat)/K_m)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。【结论】将Asp~(320)突变为Gly~(320)显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp~(320)对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。     

一种快速检测分离溶藻细菌方法的初探

传统的细菌培养基对铜绿微囊藻具有毒性作用。会大大影响溶藻细菌的筛选效率和准确性。通过基本培养基各成分对铜绿微囊藻DS的作用研究发现,培养基中的葡萄糖成分对藻有抑制作用,并且这种抑制作用与培养基中的葡萄糖浓度密切相关,当培养基中葡萄糖的浓度在0．1～0．4g/L时,藻细胞生长受到抑制,当用柠檬酸三钠取代葡萄糖后,铜绿微囊藻在改良后的培养基中生长正常,与对照组相比无显著性差异(P＜0．05)。用改良的培养基富集水样中的溶藻微生物,并用此培养液直接感染宿主藻,一周内即可初步快速检测是否含有溶藻细菌。此种方法既排除了培养基的干扰因素,又迅速增加了溶藻细菌的生物量,并可大量收集细菌分泌的胞外物质,为溶藻细菌尤其以分泌物质溶藻的细菌的初步筛选提供了一条快捷、有效的途径。     

变温对橡胶树雄蕊培养植株再生能力的影响(简报)

温度是极为重要的培养条件【’一则。培养物对温度的要求受到多种因素影响,这些因素包括外植体的基因型［’］、供体植株的环境条件［qLJ及外植体的培养时期131。我们曾报道了分阶段进行恒温培养的试验结果1’］,揭示了在橡胶雄蕊培养过程中对温度的要求因培养阶段不同而存在     

Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性

为改良米曲霉（Aspergillus oryzae）糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr¹³（Y13）置换为Phe（F）。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^Y13F;以重组质粒pPIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因（Aoxyn11A）中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因（Aoxyn11A^Y13F）;分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^Y13F在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^Y13F的耐热性进行了分析。结果表明：突变酶的最适温度T_opt由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^Y13F在50℃的半衰期t_1/2⁵⁰为95 min,较AoXyn11A（t_1/2⁵⁰=6 min）延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定

研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,human ECV304)凋亡的作用.诱导含pET-28a( )vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白,应用Ni2 亲和层析方法对rVvhA进行纯化:利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性;绵羊红细胞裂解试验对复性后的rVvhA进行溶血活性初步测定:MTT法检测rVvhA对人ECV304细胞的体外毒性作用:应用Hochest33342/PI活细胞荧光双染及流式细胞术分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响.结果显示,用Ni2 -NTA His Band亲和层析柱纯化rVvhA纯度达88.6%左右;复性后的rVvhA有一定的溶血活性,其溶血活性具有时间.剂量依赖性;MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0 HU/ml rVvhA作用人ECV304 12 h后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5 HU/ml rVvhA处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0 HU/ml rVvhA处理组加用40μmol/L caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0 HU/ml rVvhA处理组有一定程度降低.rVvhA对人ECV304细胞具有诱导凋亡的生物学活性,推测诱导调亡途径可能与caspase家族有关.     

干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶突变体在毕赤酵母中的表达及其不对称还原苯丙酮酸

为提高L-苯乳酸(L-phenyllactic acid,L-PLA)的生产效率,以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-Lc LDH1Q88A/I229A为研究对象,实现其在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达,并与葡萄糖脱氢酶SyGDH偶联,构建并优化体外辅酶循环体系,不对称还原苯丙酮酸(Phenylpyruvate,PPA)制备L-PLA。结果显示,毕赤酵母重组酶re Lc LDH1Q88A/I229A的表观分子量为36.8 kDa,比活力为270.5 U/mg,是原酶的42.9倍。在40℃,初始pH为5.0,底物PPA、辅酶NAD+和葡萄糖浓度分别为100、2和120mmol/L,SyGDH和re Lc LDH1Q88A/I229A添加量分别为1和10U/mL的最优条件下,L-PLA的产率可达99.8%,对映体过量(ee)值99.9%,时空产率和平均转化率分别高达9.5 g/(L·h)和257.0 g/(g·h)。结果表明,re Lc LDH1Q88A/I229A在不对称还原PPA制备L-PLA中生产效率高,具有工业应用的潜力。