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1.
应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右。用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1:8-1:16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。  相似文献   
2.
对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6%、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3%,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-175个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型。另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%。  相似文献   
3.
本研究根据Wesseling(1992)发表的K378株犬冠状病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因序列,设计合成了2对寡聚核苷酸引物P_1(18 bp,1520~1537 bp)、P_2(19 bp,2072~2090 bp)和P_3(20 bp,2621~2640 bp)、P_4(20 bp,2944~2963 bp)。采用异硫氰酸胍法分别从美国参考株CCV NL-18和两个国内分离株CCV YS1、CCV CI1接种的CRFK细胞培养物中提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链后,  相似文献   
4.
鸡肾型传支病的病原(IBV)为冠状病毒,该病毒的血清型较多,不同型之间小能完全交叉保护,而且血清型的分布有一定的地区性,故研制适用于本地区的疫苗是控制本病的最佳途径。本研究从典型病变鸡尸中分离出6株IBV,用10d龄鸡胚传至4代后,经系统鉴定及电镜观察,确认了所分离每株JN6为IBV。测定分离株JN6EID5n为10-4.375,对照标准株(澳大利亚T株)为10-3.243。经琼脂扩散试验分析,2毒株在抗原结构上存在一定差异,故选用此2株为种毒,经鸡胚增殖后,收取尿囊液,按1:1混合后火活,按1:3制成油性剂议价大活疫苗,再经杂检、…  相似文献   
5.
在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40.2%-99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%-99.O%之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350.370、439.478、1718.1818三个区域碱基变异较大,而1060.1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc.1弱毒多一个;其中第566.568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。  相似文献   
6.
首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT—PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCV标准毒株Insavc—1N基因相比,核苷酸的同源性为92.6%,推导的氨基酸的同源性为93.2%。在推导的N蛋白N端156—179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc—1株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET8a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IFTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49.3%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。  相似文献   
7.
首次构建了能表达犬冠状病毒纤突糖蛋白(CCVS1)的重组犬2型腺病毒(CAV-2)。用RT-PCR方法从CCVDXMV株细胞培养物中扩增出编码S糖蛋白A、B、C和D4个抗原位点的基因片段S1,将其克隆到pVAX1中,然后将含有CCVS1基因的完整表达盒(CMV-S1-PolyA)进一步定向克隆到含有CAV-2E3区的穿梭质粒pVAXE3中,构建出pVAX△E3S1。通过SalⅠ NruⅠ双酶切pVAX△E3S1回收含有目的基因的表达盒,将其克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,获得重组质粒pCAV-2-CCV-S1。ClaⅠ AscⅠ酶切pCAV-2-CCV-S1释放重组基因组,转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-S1。该重组病毒在MDCK细胞上能产生典型的腺病毒细胞病变。通过mRNA水平和Westernblot检测,证实重组病毒能表达CCVS1蛋白。动物免疫试验表明,该重组病毒可以有效地诱导免疫犬产生抗CCV和CAV-2抗体。  相似文献   
8.
犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析.3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽.DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6% 、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3% ,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大.国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-17 5个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性.基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型.另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%.  相似文献   
9.
采用双脱氧链终止法测定了首次分离于我国犬脾脏和肠内容物的两株犬冠状病毒(CCV) CCV YS1和CCV CI1,以及从美国引进的CCV NL-18株P_1、P_2和P_3、P_4引物间(见上文,两引物间核苷酸片段大小分别为57 bp和343 bp)的部分纤突蛋白(S)基因序列,并用DNASIS和PROSIS计算机软件进行了比较分  相似文献   
10.
从死亡大熊猫的肝脏中直接提取细胞总RNA,经反转录后,用犬瘟热病毒的两对引物,分两段扩增出融合蛋白基因3′端的片段。经序列分析表明:此片段的长度为693bp;此毒株在核苷酸和氨基酸水平与某疫苗弱毒株、Onderstepoort弱毒株、海豹瘟热病毒2型毒株和海豹瘟热病毒1型的同源性分别为97.5%和96.2%、88.6%和94.5%、92.9%和95.6%、63.2%和76.5%;大熊猫毒株与其它毒株融合蛋白3′端疏水性和二级结构均有一定差异;其非编码区比国外报道的Onderstepoort弱毒株多9个碱基,在非编码区最后58个碱基,两毒株仅有17个相同。至于这种差异的生物学意义尚待进一步的研究  相似文献   
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