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高甲基化的CpG岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容。现在已有很多检测CpG岛甲基化的方法,但由于各自的局限,还没有建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化CpG岛的富集方法。本研究利用甲基化结合蛋白MBD2b具有特异性结合甲基化DNA的特性, 建立了一种基于DNA免疫共沉淀技术的全基因组甲基化CpG岛的富集方法。在大肠杆菌中表达重组的GST-MBD2b蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B对重组蛋白进行纯化,制备成亲和层析柱,利用在不同的盐离子强度下甲基化DNA和非甲基化DNA的结合能力不同,对甲基化DNA进行富集。用甲基化酶SssI处理过的DNA片段与非甲基化DNA片段进行富集效率的检测,发现0.5M KCl的浓度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分开的临界条件。样品的富集效率用Real Time PCR进行检测。结果表明,这种方法能够实现对全基因组甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍数可达到100多倍。富集到的甲基化DNA可以进行后续的定量PCR, DNA测序和全基因组芯片的分析等工作,为大规模分析全基因组CpG 岛甲基化的改变奠定了基础。 相似文献
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猪背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的差异表达和主成分分析 总被引:2,自引:0,他引:2
骨骼肌细胞和脂肪细胞在分化生长速度上相对竞争的平衡点是猪肉质和胴体性状的决定因素.利用Oligo功能分类芯片检测了瘦肉型的长白猪和脂肪型的太湖猪在初生、1、2、3、4和5月龄间背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的动态表达变化.差异表达分析结果显示,在初生至5月龄的品种间分别有15、16、11、13、18和20个基因的表达差异倍数大于2倍.品种内的方差分析表明,长白猪分别有18和22个基因,太湖猪分别有3和7个基因在月龄间的表达差异达极显著(P<0.01)和显著水平(P<0.05).主成分分析结果显示,先降后升是两品种内最具代表性的基因表达模式,且长白猪和太湖猪分别有7和6个基因的表达模式明显偏离其他基因,提示其可能受到了重要的调控. 此外,5个差异表达基因的荧光定量RT-PCR验证结果均与芯片结果呈正相关趋势.以上结果筛选出了对于猪肉质和胴体性状可能具有重要影响,值得深入研究的一些候选基因,为深入研究生长发育过程中参与肌纤维生长和脂肪酸合成关键基因的表达变化规律和互作调控机制提供了基础数据. 相似文献
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蛋白质芯片技术应用于高通量单克隆抗体制备研究 总被引:1,自引:0,他引:1
针对在传统的单克隆抗体制备过程中进行特异性筛选时大量的人力消耗,建立了一种联合应用蛋白质芯片进行单克隆抗体制备的方法。用8种重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠,在传统的细胞融合的基础上,将8种抗原免疫的杂交瘤阳性细胞混合后进行克隆化、蛋白质芯片筛选,阳性细胞有限稀释克隆化制备相关抗体。实验结果:混合克隆化共得到单克隆细胞175孔,经蛋白质芯片筛选出阳性孔119孔,选择针对单一抗原阳性的细胞连续2轮克隆化,8种重组蛋白各获得单克隆抗体细胞株1株。与经典的单克隆抗体制备相比,蛋白质芯片筛选与混合克隆化技术联合应用于单克隆抗体制备,1个筛选周期获得了8种重组蛋白的单克隆抗体细胞株,提高了单克隆抗体的制备效率,节省了在筛选中的抗原用量,提供了一种经济、快速、简便的方法。 相似文献
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耗资30 亿美元历时10 余年完成的人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)给基因组学研究带来了翻天覆地的变化,通过测定人类基因组DNA 的序列,探寻基因在染色体上的位置,明确基因的结构和功能,解读人类的全部遗传信息,人类第一次在分子水平上全面认识自我.在这期间,建立了两项非常重要的高通量技术:基因芯片和新一代测序技术.这两种技术进一步结合,就产生了一种新的解决方案:目标序列捕获测序技术.新一代测序技术的发展和成功应用使得普通实验室对整个人类基因组进行测序成为可能,由此,科学家们提出了千元人类基因组计划①. 相似文献
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长白猪和太湖猪不同生长阶段脂肪中肉质和胴体性状相关基因的表达谱分析 总被引:2,自引:0,他引:2
动物个体的皮下脂肪厚度(subcutaneous fat thickness,SFT)和肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量取决于活体内脂肪酸合成与氧化竞争的动态平衡点.利用包含140个与猪脂肪沉积、代谢和肌肉生长密切相关基因的Oligo功能分类基因芯片检测了脂肪型的太湖猪和瘦肉型的长白猪在1,2,3,4和5月龄间背部皮下脂肪中这些基因的动态表达变化,发现长白猪有25个基因在月龄间的表达差异达显著水平(P〈0.05),且包含23个基因的“参与脂肪或类固醇代谢的酶和调节蛋白”基因分组在品种间具有极显著意义(P〈0.01).提示两猪种脂肪沉积能力的巨大表型差异可能与这些基因的差异表达规律密切相关.STEM聚类分析显示长白猪和太湖猪各有两个表达模式分别具有极显著(P〈0.01)和显著性意义(P〈0.05),但太湖猪基因表达谱比较分散,占主导优势的表达模式没有长白猪明显.提示太湖猪脂肪细胞内参与相关代谢活动的基因间的调控关系较长白猪复杂.基于动态贝叶斯模型构建的基因调控网络从一定程度上反映了两猪种在脂肪沉积代谢相关生理生化活动方面存在的明显差异,可从中挖掘相关性状潜在的关键特征基因.此外,对5个差异表达基因的荧光定量RT-PCR验证显示两种实验方法结果的相关系数平均高达0.874±0.071.以上结果筛选出了对于猪脂肪相关性状可能具有重要影响并值得深入研究的一些基因,初步揭示了生长发育过程中脂肪细胞基因表达调控的分子互作机制. 相似文献
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Y2受体亚型是早期发现的NPY的两种主要受体亚型之一,参与NPY所介导的多种生理和病理功能.为了制备Y2受体抗体和开展Y2受体的定位研究,用RT-PCR方法从大鼠海马的总RNA扩增NPY的Y2受体全长基因,接着PCR扩增Y2受体的C端片段,克隆入表达载体中,建立了重组NPY Y2受体C端肽的表达菌株,并对表达产物进行纯化. 相似文献
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