金柑花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索金柑花发育的分子机制并研究与金柑花发育相关重要基因编码的蛋白质之间的相互作用,本研究以融安金柑不同生长时期的花蕾为材料,采用SMART技术构建了cDNA文库,对该文库进行了鉴定评价。经检测,所构建的cDNA文库滴度为2.83×10^8cfu/mL,文库库容为1.42×10^10cfu,重组率为97.91%,插入的双链cDNA片段长度主要分布在250~2 000 bp之间。结果表明,该文库达到了建库标准,理论上涵盖了全部与融安金柑花蕾发育相关的基因,为后续利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白提供了物质基础。     

一种高效获取基因5′末端的RACE方法

RACE技术是一种快速高效克隆基因5′末端和3′末端的方法,是获取基因全长的主要手段之一,但是RACE技术本身也存在一些缺点。我们在前人改良的RACE技术基础上进一步优化RACE技术,获得了一种操作简单、快速、高效、成本低廉的改良RACE方法,该方法适合于大量基因5′末端的获取,可以在普通实验室推广应用。     

芒果APl同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个APl同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl-1(GenBank accession No.FJ529206)和MAPl-2(GenBank accession No.FJ529207).MAPl-1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741 bp,蛋白质分子量为28.54kD,等电点为8.31;MAPl-2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744 bp,蛋白质分子量为28.78 kD,等电点为8.70.同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物APl同源基因的一致性为72%～81%.实验分析表明,MAPl-1和MAPl-2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异.蛋白二级结构预测显示,MAPl-1蛋白有12个a-螺旋,4个β折叠区,14个β-转角;而MAPl-2蛋白有11个a-螺旋,5个β折叠区,15个β-转角:其大多数氨基酸具有亲水性.本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段.     

罗汉松遗传多样性的SCoT分析

采用SCoT分子标记技术对8份罗汉松种质材料进行遗传多样性研究。结果表明,从80条引物中筛选出10条重复性好、条带清晰的引物进行PCR扩增,共产生136条带,其中多态性带122条(占88.97%),8个罗汉松种质间的遗传相似系数范围在0.39～0.80说明罗汉松的遗传多样性丰富。利用UPGMA进行系统的聚类分析显示,将8份罗汉松材料分为2大类;主成分分析结果与聚类分析结果相一致。可见,利用SCoT分子标记可有效的分析罗汉松种质资源的遗传多样性,为罗汉松种质亲缘关系的鉴别和分类提供理论依据。     

柠檬总RNA提取方法研究

为了获得高质量的柠檬RNA,本研究从操作时间、成本、所得RNA的纯度与浓度等方面比较了5种方法提取香水柠檬不同组织总RNA的效果,并筛选最适合提取柠檬组织样品RNA的方法。结果表明:改良的RNA试剂盒提取法效果最好。该方法极适合提取香水柠檬总RNA。利用此方法可以成功提取白花柠檬、广西土柠檬和金柑的总RNA,也可以提取高质量的芒果总RNA。     

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态(start condon tardeted polymorphism,SCoT)分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单、成本低廉、多态性丰富、重复性好、引物设计简单且通用性良好等诸多优点.本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液(Mg~(2+))及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响.结果表明:龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为:10×Buffer Ⅱ(含Mg~(2+))2.0μL、DNA模板30 ng、引物浓度为30 μmol/L、rTaqDNA聚合酶用量为0.45 U、dNTP浓度为4.0 mmol/L.适宜的扩增程序为:94℃预变性4 min;95℃变性50 s,49.5℃退火40 s,72℃复性2 min,36个循环;最后72℃延伸10 min.利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400～2 200 bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性.     

cDNA-SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究

应用cDNA-SCOT研究了低温胁迫下不同抗寒性甘蔗品种的基因差异表达,比较了两种PCR产物电泳方法。结果表明,采用琼脂糖凝胶电泳成本较低,操作简单,省时,其凝胶图像条带亮白,背景为黑色,主带明显,副带较模糊;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳成本较高,操作复杂,耗时,其凝胶电泳图像条带呈黑褐色,背景为浅黄色,主带和弱带清晰易读,但部分引物泳道背景深,影响差异基因鉴别效果。根据两种电泳方法的优缺点,提出应用cDNA-SCOT进行基因差异表达研究时的相关建议。     

37份龙眼种质资源亲缘关系的ISSR分析

本研究利用ISSR技术对37份龙眼种质资源进行遗传多样性检测.研究结果表明,从100条ISSR引物中筛选出7条重复性好,条带清晰的引物对37份龙眼品种基因组DNA进行扩增,共扩增出54条带,其中43条具有多态性,比率为79.6%.不同龙眼品种间遗传相似系数变幅为0.69～0.97,平均达0.83,说明ISSR标记能够揭示材料间较高的遗传多样性.UPGMA聚类结果表明,ISSR标记能将37份龙眼品种完全区分开,并能将来源于中国、越南和泰国的37份龙眼品种分别聚类到中国、越南和泰国三大品种群,说明龙眼品种资源的亲缘关系与地理因素有关,三个国家的龙眼品种之间存在较大的遗传差异.本研究结果将为为龙眼品种资源的研究利用提供参考.     

可降解的非病毒基因载体的研究进展

选择合适的基因载体是基因治疗成功与否的一个关键环节,合适的基因载体应该具备较高转染效率,较好的组织相容性以及生物安全性等特点。相较于传统的病毒基因载体,非病毒基因载体具有低免疫原性,易于制备以及载药量大等特点,是较为理想的基因载体。而寻求可降解的非病毒基因载体可使其更为安全深入的应用到体内以及临床,意义重大。本研究就对常见的几种可降解的基因载体的转染效果及相关改性做一综述,为研究可降解非病毒基因载体的新方法提供新思路。     

柠檬UBE2I同源基因的克隆及表达模式分析

前期从香水柠檬自交不亲和花的转录组数据中筛选到一个上调表达的泛素结合酶UBE2I同源基因片段,为了弄清该基因的特性,开展了本研究。以香水柠檬(自交不亲和)和白花柠檬(自交亲和)为试材,根据从香水柠檬花转录组中获得的UBE2I基因片段设计引物,采用同源克隆方法获得了香水柠檬和白花柠檬这2个品种中UBE2I同源基因的ORF全长和DNA全长,对其序列进行生物信息学分析,再对其表达模式进行探讨。结果显示UBE2I基因在香水柠檬和白花柠檬中的ORF长度均为483 bp,二个品种ORF全长仅有一个核苷酸的差异,编码160个氨基酸,但其氨基酸序列无差异;DNA全长为2 267 bp,拥有有5个外显子和4个内含子,在第2个和第4个内含子序列中存在2个类似于启动子(TATAA)框的结构。UBE2I泛素连接酶蛋白理论等电点为7.64,分子量为17 981.474 44 Da,三级结构中有4个α螺旋、7个β折叠和10个无规卷曲,不是分泌蛋白,没有跨膜结构,肽链呈现疏水性。时空表达分析表明,UBE2I基因在香水柠檬的不同组织中均表达,但在不同组织中的表达存在差异,其中在花粉中的表达量明显高于其它组织,UBE2I在自交(香水柠檬♀×香水柠檬♂)后柱头中的表达量均比(香水柠檬♀×白花柠檬♂)杂交后柱头中的表达量高。本研究为进一步探索发现自交不亲和过程的泛素结合酶UBE2基因奠定基础。