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1.
Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点, 但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5~7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降, 为了进一步改良Q23L的pH稳定性, 在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明:突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高, 在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg, 但其pH稳定性, 尤其是在pH3.0~4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0~4.5和pH6.5~7.0时的稳定性比Q23L有所提高, 恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。  相似文献   
2.
果胶甲酯酶的结构与功能研究进展   总被引:1,自引:0,他引:1  
王胜  孟昆  罗会颖  姚斌  涂涛 《生物工程学报》2020,36(6):1021-1030
果胶甲酯酶(PME)是一种重要的果胶酶,其水解果胶中的甲酯基从而释放甲醇并降低果胶的甲酯化程度。目前在食品加工、茶饮料、造纸等生产工艺中有着广泛的应用前景。随着对PME的深入研究,已报道了几种不同来源的酶晶体结构,对这些已获得的晶体结构进行分析发现,PME属于右手平行β-螺旋结构,其催化残基为2个保守的天冬氨酸和1个谷氨酰胺残基,并且在催化过程中分别起到了一般酸碱、亲核试剂以及稳定中间体的作用。同时对其底物特异性进行分析,初步了解其底物与活性位点的识别机制。文中针对这几个相关方面进行了系统的综述。  相似文献   
3.
【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。  相似文献   
4.
葡萄糖淀粉酶作为淀粉糖化的关键用酶之一,广泛应用于食品、医药和发酵工业等行业。由于整个制糖过程都是在高温下完成的,因此对葡萄糖淀粉酶的反应温度和热稳定性有较高要求。本研究从嗜热篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆到一个糖苷水解酶第15家族(GH15)葡萄糖淀粉酶基因(Tlga15A)并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。重组葡萄糖淀粉酶TlGA的最适pH为4.5,在75℃下表现出最高酶活。TlGA热稳定性好,65℃条件下处理1 h剩余70%以上酶活力;70℃处理30min后仍有43%酶活力。TlGA有较强的离子抗性和宽泛的底物特异性,TlGA水解可溶性淀粉、支链淀粉、糖原、糊精和普鲁兰的比活力分别为(255.6±15.3) U/mg、(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg。从葡萄糖淀粉酶TlGA的一级结构、二级结构和三级结构3个层面对其进行比较分析,发现一级结构中较少的Gly组成和三级结构中较低的非极性基团溶剂可及表面积可能是维持葡萄糖淀粉酶TlGA温度稳定性的主要原因。综合其性质特点和对结构的分析,葡萄糖淀粉酶TlGA在工业葡萄糖生产中有较大应用潜力。  相似文献   
5.
【目的】在毕赤酵母中高水平表达蓝状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的高温果胶甲酯酶,并对其进行酶学性质研究,具有高催化效率的高温果胶甲酯酶有望能广泛应用于低甲氧基果胶的生产,优化生产工艺,提高转化率,降低生产成本。【方法】利用RT-PCR的方法,以蓝状菌(T.leycettanus JCM12802)总RNA为模板,克隆得到果胶甲酯酶基因(Pme T)的cDNA。将其插入表达载体p PIC9K,并转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115,高活性的阳性转化子进行高密度发酵研究。【结果】重组酵母的果胶甲酯酶表达水平达到428 U/m L,并进一步鉴定了重组果胶甲酯酶的酶学性质。该酶的最适反应温度为75°C,且在85°C以下具有较好的热稳定性。最适反应p H为4.0,在p H 2.0-7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达蓝状菌来源的高温果胶甲酯酶,为其今后在工业上的应用奠定了基础。  相似文献   
6.
为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。  相似文献   
7.
【背景】作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛。来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorbescii)的GH10家族木聚糖酶Cb Xyn10C最适温度为85℃,在80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力。【目的】为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理。【方法】以Cb Xyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排2种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制。【结果】共获得了4个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优。随着在A45P基础上另外3个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升。获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型...  相似文献   
8.
通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性   总被引:4,自引:0,他引:4  
以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析比较。分析表明,融合蛋白TB最适pH值为6.0,最适温度为70℃,较XYNB有大幅度的提高;在热稳定性方面,TB明显优于XYNB,将两种稀释好的酶液分别在80℃和90℃下热处理3min,TB的热稳定性较XYNB提高了6倍左右;TB的pH稳定性为5~9(相对剩余活性在50%以上的pH范围),较XYNB有所下降,但两者的比活性基本不变,保持了亲本XYNB的高比活性。通过同源建模和序列比较,分析了可能影响融合蛋白TB酶学性质的因素,为进一步研究木聚糖酶的结构与功能提供了新的思路。  相似文献   
9.
甘露聚糖酶和木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶,在食品、饲料、纺织、造纸等工业应用广泛且通常搭配使用。文中将蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的性质优良的甘露聚糖酶编码基因man5A的CBM(Carbohydrate-bindingmodule)编码区去除,留下连接区和催化区,并将木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟区编码序列与man5A的连接区进行融合,形成Tlxyn11B-linker-man5A融合基因,并在毕赤酵母中成功表达,获得了融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。Tlxyn11B、不含CBM区的Man5A和Tlxyn11B-Man5A的理论分子量分别为21.6kDa、41.0 kDa、62.6 kDa。对纯化后的融合蛋白进行了性质分析,融合蛋白同时具有高的木聚糖酶和甘露聚糖酶活性。融合后的木聚糖酶的最适温度为70℃,较单独表达时提高了5℃。甘露聚糖酶的最适温度为90℃,与融合前一致。融合后的木聚糖酶热稳定性明显提高,60℃处理1 h剩余48%的酶活力,单独表达的木聚糖酶60℃处理20 min仅剩余20%的酶活力。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH分别为4.0和5.0,较单独表达时分别提高了0.5和1.0个单位,融合后酶的作用pH范围有所拓宽。融合前后的蛋白均具有较好的pH稳定性。融合后木聚糖酶和甘露聚糖酶的比活分别为1 784.3 U/mg和1 639.6 U/mg,较单独表达时比活(8 300 U/mg和1 979 U/mg)降低,与融合酶分子量增大相关。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的K_m值分别为1.2 mg/mL和1.7 mg/mL, V_(max)分别为2 000.0μmol/(min·mg)和2 831.6μmol/(min·mg)。综合其性质特点,融合木聚糖酶和甘露聚糖酶在饲料、食品等工业生产中有较大应用潜力,并为酶的性能改良提供了新的思路。  相似文献   
10.
Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点,但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5~7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降,为了进一步改良Q23L的pH稳定性,在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明:突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高,在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg,但其pH稳定性,尤其是在pH3.0~4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0~4.5和pH6.5~7.0时的稳定性比Q23L有所提高,恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。  相似文献   
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