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利用TAIL-PCR克隆耐盐基因及其分析 总被引:1,自引:0,他引:1
通过大量筛选得到一株高耐盐的豇豆根瘤菌WME7,最高可耐15g/L NaCl,利用Tn5-sacB转座子对该菌株进行随机插入突变,从突变子中筛选获得30个共生缺陷型突变株。利用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)方法克隆了突变株Tn5-sacB侧翼序列,通过BLAST发现有1个突变株的插入失活基因与鼠伤寒沙门氏菌抗银的结合蛋白SilE有94%同源性,表明有关Na+离子的抗性基因可能与Ag+离子的抗性基因有某种关系。该基因在其它菌中也能抗其它金属离子(铜、锌、钴、铬)。 相似文献
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2020是一株分离自中国南方水稻田里的华癸中生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii),有3个内源质粒,分别命名为p2020a,p2020b和p2020c.用Tn5-sacB插入突变的方法对2020进行质粒消除,得到了两株质粒缺失突变株20201)29和2020D8.缺失了第一大质粒p2020c的突变株2020D29的结瘤固氮能力有显著的提高;而缺失了第二大质粒p2020b的突变株2020D8失去了在紫云英(Astragalus sinicus)上结瘤的能力;第三大质粒很难被消除,原因可能是该质粒上含有菌株生长所必需的基因.然后将豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)的共生质粒pJB5JI转入2020及其质粒缺失突变株中,盆栽结果显示,2020-137(pJB5JI)的竞争结瘤能力和固氮能力显著高于2020.但是pJB5JI不能恢复2020D8在紫云英上的结瘤能力.2020D8—8(pJB5JI)可以在豌豆(Pisum sativum Linn)上形成无效瘤,这说明pJB5JI的功能可以在2020的遗传背景下进行表达.对pJB5JI在受体菌中的稳定性进行检测,结果发现在人工传代的情况下pJB5JI可以稳定的存在,但经过与植物共生之后只能在部分根瘤分离物中检测到pJB5JI,对这些转移接合子和出发菌株及分离菌株进行Km基因的PCR扩增,除了出发的受体菌外其余的菌株都可以得到PCR产物.由此推断,在没有检测到pJB5JI的分离株中,pJB5JI可能部分或全部整合到了受体根瘤菌的染色体DNA中. 相似文献
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【目的】本研究对尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnE基因进行克隆表达,并对agnE基因表达蛋白进行功能鉴定。【方法】通过PCR扩增获得agn 全长基因(1029 bp),构建重组质粒pET28a-agnE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。以2,5-二羟基吡啶作为反应底物,在检测波长320 nm下测定反应液吸光度值,进一步研究温度、pH值和金属离子对AgnE蛋白酶活性的影响。【结果】克隆得到基因agnE,构建了p ET28a-agnE重组质粒并进行了表达,AgnE蛋白分子量为42.0 kDa,表达蛋白以包涵体形式存在于细胞中。酶促反应0、5、10、20 min时反应液吸光度分别为0.6170、0.2273、0.0907、0.0667。在pH 8.0、温度20°C下,AgnE蛋白具有较高的2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性,且Fe2+对酶活性具有明显的促进作用。【结论】明确了Agn E蛋白具有2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性。 相似文献
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为了开发利用新疆盐碱地的耐盐菌资源,从该盐碱地土样中分离并纯化出11株耐盐能力较高的菌株,并从形态特征和16S rDNA序列分析对这些菌株进行鉴定。结果表明,11个菌株均为产芽胞,革兰氏阳性细菌。通过对这11个菌株的16S rDNA进行测序和同源性比较,发现它们与芽胞杆菌的相似性均达到99%。因此,这些菌株被鉴定为Bacillus sp.。11株菌均不能在NaCl质量浓度大于220 g/L条件下生长,属于中度耐盐菌株。耐盐基因的PCR扩增结果表明,只有NYT21、23、25、27、29等5株菌株含有pro耐盐基因,暗示这些耐盐芽胞杆菌具有不同的耐盐机制。 相似文献
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【目的】从丝茅草中筛选得到产蛋白酶菌株并研究驯化过程中微生物群落结构,以及探究该菌株的生长特性和蛋白酶的酶学特性。【方法】通过高通量测序探究来源于丝茅草的菌株在不同培养条件下细菌种类及丰度,通过选择性培养基来筛选能够分解酪素并产生蛋白酶的菌株,通过单因素试验方法确定环境因子对菌株生长和蛋白酶活性的影响。【结果】微生物群落结构在基础培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中不同。通过含酪素的选择性培养基里筛选到1株产蛋白酶菌株H-16,经生理生化试验和16S r DNA鉴定知该菌株属于Escherichia marmotae,菌株H-16能产生分子量为70 k Da左右的单亚基蛋白酶。胰蛋白胨、蔗糖、30°C或35°C、p H 7分别为菌株生长的最适氮源、碳源、温度和p H。菌株H-16分泌的蛋白酶最适p H为6–8,在50°C及6%盐度以下酶活性几乎不受影响。此外,Cu(II)和Ag(I)等金属离子能够抑制蛋白酶的活性。【结论】该菌株H-16为嗜中温菌株,能够产生碱性蛋白酶。 相似文献
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【目的】分离并鉴定1株具有尼古丁降解能力的细菌,研究其尼古丁降解特性并对其降解基因进行分析,为尼古丁微生物降解提供基础。【方法】从烟草种植地土壤中分离1株具有尼古丁降解能力的细菌,通过16S r RNA基因和生理生化特性对该菌株进行鉴定,检测该菌株尼古丁降解率与生长量的关系,并进一步对该菌株进行尼古丁浓度耐受性测定,采用高通量测序技术对菌株进行全基因组测序,BLAST比对分析尼古丁降解相关基因。【结果】筛选到1株具有尼古丁降解能力的细菌,经鉴定命名为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumerficience)SCUEC1菌株,根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解率可达到94.81%,该菌株在尼古丁浓度为0.50–5.00 g/L范围内生长良好且有较高的尼古丁降解能力。对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株全基因组序列进行BLAST比对分析,推测该菌株的尼古丁降解代谢途径与中间苍白杆菌SYJ1菌株的尼古丁降解途径相似。【结论】本研究揭示了Agrobacterium tumerficienceSCUEC1菌株具备尼古丁降解特性,初步推测出尼古丁降解相关基因和降解代谢途径,为尼古丁微生物降解提供基础。 相似文献
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katG基因在豌豆根瘤菌抗氧化中的功能 总被引:1,自引:0,他引:1
摘要:【目的】细菌中过氧化物/过氧化氢酶KatG参与活性氧(ROS)的解毒过程,从而防止其对细菌生长伤害,本文研究根瘤菌中katG基因的抗氧化功能对豌豆根瘤菌3841生长及共生固氮的影响。【方法】通过基因敲除、遗传互补和对菌株的抗氧化和共生能力分析,系统地探究了根瘤菌中katG基因的功能。【结果】katG基因突变不影响菌株在自生培养条件下生长状况,但H2O2短时间处理导致突变株的存活率显著下降。实时荧光定量RT-PCR结果显示,H2O2不能诱导豌豆根瘤菌3841katG基因的表达。进一步研究发现突变体中katG基因缺失能显著提高抗氧化基因ohrB的表达,而降低grxC基因的表达。植物盆栽实验发现,katG突变虽然对根瘤菌共生固氮能力和竞争结瘤能力均无影响,但katG在类菌体中表达显著下调。同时,katG突变显著影响了根瘤菌在植物根圈中的定殖能力。【结论】研究表明katG虽对豌豆根瘤菌自生和共生固氮无明显影响,但在抗氧化和根圈定殖中起重要作用,外源H2O2对katG的表达无诱导作用,但katG调节ohrB和grxC等抗氧化基因的表达,从而在抗氧化和共生中发挥作用。 相似文献