LipofectAMINE和Vigofect转染特点的比较研究

目的 :评估新型转染试剂Vigofect介导gfp - 2mar基因转染BHK细胞的转染效率及其对细胞的毒性作用 ,并与传统转染试剂LipofectAMINE进行比较。方法 :将适量的gfp - 2mar分别用等量的LipofectAMINE和Vigofect转染BHK细胞 ,于转染后 4 8h用MTT比色法检测活细胞数 ,以GFP为报告基因 ,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪计数荧光细胞 ,检测转染效率。结果 :Lipo fectAMINE转染组细胞存活率为 96 .5 1± 3.12 % ,显著大于Vigofect转染组 6 1.4 3± 16 .89% (P <0 .0 1) ;Vigofect转染效率为 5 9.2±19 .5 1% ,显著高于LipofectAMINE 10 .72± 8.17% (P <0 .0 2 )。结论 :与LipofectAMINE相比较 ,Vigofect对细胞毒性较大 ,但转染效率较高     

鸡α-珠蛋白基因 5''''端 MAR调控GFP的表达

目的观察不同细胞密度、不同转染时间MAR对GFP表达的影响.方法采用脂质体法将pcmv/gfp与pgfp/mar两个真核表达载体转染人的神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y).结果在细胞密度为3.0×10 5cells/ml,转染后72h GFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下,pgp/mar比pcmv/gfp表达要高.结论初步证明该MAR能够提高GFP的表达.     

过表达bFGF促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成

研究过表达人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）在大鼠急性心肌缺血模型中的表达及其对心肌血管 再生的影响. 将含人bFGF质粒pcDNA/b转染人脐带静脉内皮细胞（HUVEC） ,进行MTT检测. pcDNA/b转染人肾细胞293细胞系,进行G418稳定筛选, Western 印迹检测.建立大鼠急性心肌梗死模型,分别将生理盐水、空质粒 pcDNA3.1(+)和pcDNA/b分3点注射于梗死交界处心肌内4周后取材,做常规 HE 染色和Masson 染色,测量各组微血管数量和梗死面积. 经免疫组织化 学染色鉴定和电镜观察,过表达外源bFGF可以促进HUVEC（细胞）生长; pcDNA/b能在293细胞中高效表达外源bFGF基因. pcDNA/b注射组梗死交界处 可见大量新生血管,毛细血管总数明显大于对照组,梗死面积明显小于对 照组. pcDNA/b组在梗死交界区有bFGF阳性表达.电镜观察显示,在梗死交界 处心肌细胞间有毛细血管增生,分化成2个血管腔.本实验证明,过表达bFGF 具有促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成的作用,为bFGF基因治疗缺血 性心肌病的研究提供实验基础.     

VEGF重组质粒pcDNA/V的构建及其在大鼠急性心肌缺血模型中的表达

构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)真核表达载体,并研究其在细胞水平和大鼠急性心肌梗死动物模型中的表达。利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165基因,构建真核表达载体pcDNA/V。应用脂质体介导的基因转移技术,将pcDNA/V转染至人胚肾细胞(293细胞)中,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。ELISA、Westernblot检测证实重组质粒pcDNA/V能在293细胞中高效表达外源VEGF基因,鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验证实表达产物具有促血管生成的活性。进一步的体内表达研究,建立大鼠急性心肌梗死模型,将重组质粒pcDNA/V、空质粒pcDNA3.1( )分三点注射于梗死交界处心肌内,四周后取材。经免疫组化染色检测,pcDNA/V组在梗死交界区有VEGF阳性表达;电镜观察显示,pcDNA/V组在梗死交界处心肌细胞间有大量毛细血管内皮细胞增生。实验结果表明成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内、外表达研究证实重组质粒的表达产物具有促血管生成的生物学活性,为VEGF基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础。     

人EPO高效表达细胞株的筛选与鉴定

用氨甲喋呤 (MTX)对稳定转染人促红细胞生成素 (EPO)基因的CHOˉ(DHFR缺陷型 )细胞株进行梯度加压 ,并使用α -MEM培养基进行培养 ,使DHFR基因在CHOˉ细胞中大量扩增 ,从而使EPO的表达量提高。经检测分析EPO的表达量 ,筛选出EPO高效表达的细胞株。结果表明 ,用MTX加压到 16× 10 - 7mol l和 6 4× 10 - 7mol l浓度时 ,收集的细胞培养液经 (NH4 ) 2 SO4 盐析、透析等处理得到EPO抽提液 ,经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测出与标准品相对应的一条带 ,WesternBlot证明该带确为EPO。     

VEGF治疗心肌缺血的研究进展

血管内皮生长因子(VEGF)是一种促进血管生成的生长因子,因此被用于研究心肌缺血的治疗。目前,用VEGF重组蛋白和基因治疗心肌缺血的基础和临床试验都取得了相当的进展。对这方面的进展进行了综述。