鲍姆木层孔菌多糖对HepG2细胞增殖及侵袭相关能力的抑制作用

证实了鲍姆木层孔菌多糖对肝癌细胞系HepG2细胞增殖及侵袭的抑制作用。鲍姆木层孔菌提取物经乙醇分级沉淀和DEAE-Sepharoes F.F.离子柱层析以及Sephacryl S-200凝胶柱层析纯化,获得均一多糖PLP60-B1,该多糖具有体外活性。MTT法及流式细胞仪技术证实多糖PLP60-B1通过致使HepG2细胞阻滞于S期而显著抑制HepG2细胞的增殖和细胞集落的形成,且也可显著抑制细胞的粘附及侵袭能力。     

山羊关节炎─脑炎前病毒的PCR检测

山羊关节炎─脑炎前病毒的ＰＣＲ检测相文华,丁恩雨,秦运安,吕晓玲,沈荣显（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨１５０００１）关键词聚合酶链反应,山羊关节炎—脑炎病毒,整合山羊关节炎—脑炎（ＣａｐｒｉｎｅＡｒｔｈｒｉｔｉｓ－Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ,Ｃ...     

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.     

利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH 26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度.将该检测方法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平.该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法.     

EIAV与HIV分子生物学相关性研究进展

马传染性贫血病毒 (equineinfectiousanemiavirus,EIAV)与人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus ,HIV)同属逆转录病毒科、慢病毒属成员。两者在形态结构、抗原特性、基因组构成以及病毒与宿主的持续作用等方面极为相似 ,且EIAV具有独特的快速发病进程和明显的病程分界 ,使其成为研究HIV的基因变异与临床症状之间相互关系的理想动物模型。EIAV疫苗是我国拥有自立知识产权的世界上唯一的慢病毒疫苗 ,以该疫苗为基础 ,开发新型HIV疫苗将成为今后的发展策略。近年国内外学者对EIAV及HIV的分子生物学进行了深入研究 ,确定了与病毒毒力相关的某些基因及编码蛋白 ,并在疫苗的研究上取得了一定进展。     

猪戊型肝炎病毒基因ORF2片段AG02的融合表达及间接ELISA方法的初步建立

采用巢式RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（SHEV）结构蛋白基因ORF2部分片段AG02。将该片段插入pET32a表达载体,命名为PET-HEV,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE-3）,经1mM IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,证明该片段得到融合表达,分子量为33KD。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为2.43μg/mL,血清最佳的稀释比为1:40,与万泰试剂盒相比较,证明我们建立的ELISA方法有较高的特异性和敏感性。     

马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属的成员,是马传染性贫血病的病原.二十世纪七十年代我国就研制出马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗,成为世界第一个成功地应用该疫苗控制了我国的马传贫的发生[1].而且我国的马传贫弱毒疫苗对异源的美国、古巴和阿根廷等毒株也有很高的保护率[2].因此将我国的马传贫驴细胞弱毒疫苗推向国际市场成为可能.然而目前制约该苗出口的技术问题是现行的OIE推荐的琼脂扩散实验和ELISA等血清学方法不能鉴别自然感染马与我国弱毒疫苗免疫马,针对这个关键问题,本试验采用PCR方法初步建立了一种能够鉴别美洲(美国和阿根廷)流行毒株感染马和我国弱毒疫苗免疫马的实验室检测方法,为我国疫苗能在世界范围内应用提供了配套技术.     

猪戊型肝炎核酸疫苗的构建及在BAL B/C小鼠免疫效应

将含有kozak序列及BamH I的上游引物和带有终止密码子及EcoRV酶切位点的下游引物,以猪HEVDQ1 ORF2为模板,进行PCR。将扩增片段和pcDNA3.1质粒以BamH I/EcoRV进行双酶切后进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α,经测序证明该序列正确,命名为pcDQ1。进行pcDQ1质粒提取,以Vero细胞为表达细胞进行转染,以间接免疫荧光试验进行验证。以100μg/次/只剂量的pcDQ1对BAL B/C小鼠进行免疫以获取单因子血清。共免疫3次,采集血清,进行ELISA效价测定。结果表明,该核酸疫苗可以免疫使小鼠产生抗体。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株酸性蛋白p9基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码p9蛋白的基因,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白,其氨基端带有6个组氨酸的标签,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中,重组的酸性蛋白p9可与马传贫阳性血清样品发生反应,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究 。     

利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH-26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒 (Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的 新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度。将该检测方 法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3 个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平。该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提 供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法。