结核分枝杆菌硫醇乙酰基转移酶基因敲除株的构建及其生物学特性分析

为探索硫醇乙酰基转移酶(mycothiol acetyltransferase,MshD)在结核分枝杆菌中的生物学特性,本实验利用噬菌体为载体的同源重组技术,构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株、mshD基因回补株,用实时定量聚合酶链反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)对所构建的菌株进行验证。分别收集H37Ra野生株、mshD基因敲除株、mshD基因回补株对数生长期菌液各5 mL, 离心收集菌体并培养,以观察菌落形态、生物膜形成及生长曲线测定;用5 mmol/L H₂O₂、0.05% SDS,50 ℃热激及低氧条件下分别处理基因敲出菌株和野生菌株,将菌液进行10倍梯度稀释,培养4～6周后检测抗胁迫能力并计算存活率。结果显示, 与野生株H37Ra相比,mshD基因敲除株菌落褶皱减少且菌落偏小,生长趋势较为缓慢;生物膜形成所需时间增长且褶皱明显减少;抗逆能力下降,存活率略低于野生株和回补株。揭示了mshD基因对结核分枝杆菌的生长具有重要作用,为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

新型抗结核活性化合物H37Ra的耐药菌筛选及其菌落表型

ATB-152E和ATB-152J为本实验室前期研究获得的具有良好抗结核活性的两种结构类似的小分子化合物,本文就其作用靶标及耐药机制进行探索。采用含药平板涂板筛选以及平板划线培养法逐步提高化合物浓度,分别筛选出结核分枝杆菌ATB-152E和ATB-152J耐药菌株。选取有代表性的耐药菌株,用微孔法测定结核分枝杆菌的最小抑菌浓度,分别对它们的菌落形态、生物膜形成等表型进行观察并与野生株进行比较。通过不断提高化合物筛选浓度最终筛选到ATB-152E耐药菌株17株、ATB-152J耐药菌株15株,这两种化合物的耐药频率均为10^－7。生长表型结果显示,与野生株结核分枝杆菌相比,ATB-152E耐药菌菌落褶皱变多,ATB-152J耐药菌菌落形态更为扁平,褶皱变少。耐药菌的生物膜形成所需时间与野生株也存在差异,提示活性化合物耐药菌的突变可能导致细菌脂质代谢异常。ATB-152E和ATB-152J耐药菌的获得,为后续深入探索这两种具有良好抗结核活性化合物的作用机制奠定了基础。     

耻垢分枝杆菌EF-G敲低菌株的构建和耐药分析北大核心CSCD

GTPase延伸因子G(elongation factor G,EF-G)是蛋白质翻译过程中重要的翻译因子。作为唯一在翻译延伸和核糖体再生2个翻译环节发挥重要功能的翻译因子,EF-G成为潜在的抗菌药物作用靶点。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmetics,Msm)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)基因组中均存在2个EF-G同源编码基因,分别为Msm EFG1(MSMEG_1400)和Msm EFG2(MSMEG_6535),fusA1(Rv0684)和fusA2(Rv0120c)。基因突变库和生物信息学推测Msm EFG1(MSMEG_1400)和fusA1(Rv0684)是生长必需基因。为探究分枝杆菌中EF-G的生物学功能及特点,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)技术构建了耻垢分枝杆菌中2个EF-G诱导型敲低菌株(Msm-ΔEFG1(KD)和Msm-ΔEFG2(KD)),研究发现EF-G2的敲低对细菌生长无影响,而EF-G1的敲低显著影响分枝杆菌的生长,成膜能力显著减弱、菌落形态显著变化、菌体长度显著增长,推测EF-G可能与细菌的分裂相关。最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)实验结果表明,抑制EF-G1的表达可增强分枝杆菌对利福平、异烟肼、红霉素、夫西地酸、卷曲霉素等抗菌药物的敏感性,提示EF-G1可能成为未来抗结核药物筛选的潜在靶标,为探究EF-G在分枝杆菌中的生理功能及作为潜在药物靶标提供基础。     

耻垢分枝杆菌中反式翻译报告体系的构建

细菌在翻译过程中,mRNA受到损伤(如缺失终止密码子)时会使翻译提前终止,导致核糖体熄火,细菌自身会启动核糖体拯救途径。由tmRNA-SmpB介导的反式翻译系统是结核分枝杆菌中的核糖体拯救途径,对结核分枝杆菌的生长繁殖有重大影响。为探究分枝杆菌中反式翻译途径的启动及其功能特点,本研究选取耻垢分枝杆菌为实验菌株,分别以mCherry和egfp作为报告基因,通过在报告基因3′端添加大肠埃希菌终止子序列,构建能在菌体中反映反式翻译表达的报告体系,并初步探究该体系中报告基因的动态表达特点。结果显示,相比正常表达mCherry的对照菌株,实验菌株中表达的错误mCherry蛋白很快被水解,菌体颜色均明显浅于前者,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)定量检测数据也显示错误EGFP水平显著低于正常表达的EGFP水平,表明两种反式翻译报告体系均构建成功。报告基因的动态表达数据显示,蛋白出现翻译异常时,耻垢分枝杆菌可在蛋白翻译过程中快速启动反式翻译途径,并于40～45h将不成熟错误蛋白完全水解。本研究构建的反式翻译报告体系可为后续开展分枝杆菌反式翻译途径的功能研究及抗结核药物筛选提供帮助。     

前裂长管茧蜂触角感器的扫描电镜观察

前裂长管茧蜂是许多实蝇类害虫幼虫-蛹期的重要寄生性天敌。通过扫描电镜对其触角感受器进行超微观察,结果发现,前裂长管茧蜂雌蜂触角共发现7种感受器,分别为鳞型感器、Bhm毛、毛型感器、腔型感器、栓锥型感器、钟型感器及板型感器。其中,毛型感器具有3种形态(毛型感器Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),锥型感器具有2种形态(锥型感器Ⅰ、Ⅱ),但在雄蜂触角上没发现锥形感器Ⅱ。毛型感器和板型感器是前裂长管茧蜂触角上的主要感器,数量较多,分布较广。     

结核分枝杆菌核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶过表达菌株的构建及分析

rimI基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆菌致病性的影响,本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌,构建过表达结核分枝杆菌rimI基因的重组菌株Msm∷pMV261-rimI。分别培养 Msm∷pMV261-rimI菌株和对照Msm∷pMV261菌株,分析两者生长速率、菌落形态和生物膜形成的差异,以及耐受低氧、低pH值、H₂O₂、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和0.05%～1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等逆环境的能力;并将两种菌株分别接种于鼠巨噬细胞RAW264.7,观察两者在巨噬细胞内的存活能力。结果表明,相较于对照菌株,过表达rimI的菌株在生长前中期速率降低,生物膜早期成膜变缓,但不影响生物膜的后期成熟。同时,过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH值、H₂O₂等逆环境的能力增强,在巨噬细胞内的存活能力增强。结果提示,rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用,可能与结核分枝杆菌的毒力密切相关。     

耻垢分枝杆菌ClpC和ClpX敲低表达菌株的构建及表型分析*

蛋白质平衡稳定对细菌的生长繁殖以及应对宿主免疫压力十分重要。Clp蛋白酶复合体在结核分枝杆菌的蛋白质降解和平衡稳定中发挥重要作用。Clp蛋白酶中负责识别底物蛋白并将其解折叠的蛋白质有两种:ClpC和ClpX。为初步探究分枝杆菌中ClpC和ClpX各自的功能特点,运用CRISPRi的方法成功构建了耻垢分枝杆菌的ClpC和ClpX诱导型敲低表达菌株,并对其生长相关表型进行分析。结果显示:与野生菌株相比,ClpC和ClpX的低表达均能严重影响耻垢分枝杆菌的生长。ClpC低表达可导致菌株丧失生物膜的形成能力,而ClpX低表达则导致菌株无法维持正常细胞形态,电镜显示细胞壁不完整且细胞呈丝状化,提示ClpC和ClpX可能在分枝杆菌中具有不同的生理功能。可为后期深入开展ClpC和ClpX对分枝杆菌生理调控功能研究及新型抗结核药物筛选提供基础。