反义p73基因诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡

目的：构建表达重组反义p73基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并进一步探讨其作用机制。方法：克隆p73基因的反义片段,重组法构成逆转录病毒载体pBabe-p73（pBP73）,以脂质体Lipofectamine2000将其转染293A细胞进行病毒包装;将逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2,用MTT法检测细胞生长抑制情况,Western blotting检测p73的表达;再分别用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;最后检测p53,caspase-3和bcl-2蛋白的表达变化。结果  重组质粒pBP73经鉴定连接正确,其转染293A细胞后上清液中可得到病毒,滴度达5×107pfu;MTT检测见pBP73病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（45.1% vs. 5.3%,69.5% vs.17.3%,均p<0.05）。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达20.47%;p73蛋白高表达组p53和caspase-3蛋白的表达亦有显著升高（p<0.05）,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论：成功构建了p73逆转录病毒,反义p73基因在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能机制是通过激活caspase-3而发生作用。