刚毛柽柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶(ThSAMS)基因的克隆及表达分析

通过对刚毛柽柳转录组分析,克隆获得了一条与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性高的基因,命名为ThSAMS。序列分析结果表明:ThSASM基因全长cDNA为1185bp,编码394个氨基酸,编码蛋白相对分子质量为97.85kDa,理论等电点为5.02。通过生物信息学分析表明,ThSASM基因编码的氨基酸与其他物种SAMS基因编码的氨基酸具有很高的同源性,其中与枣的同源性最高,达95%。实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)分析表明,ThSASM表达受NaCl、聚乙二醇(PEG)和ABA处理做出应答,暗示ThSASM可能参与了刚毛柽柳对盐和干旱的胁迫应答,为进一步研究SAMS基因在植物胁迫应答中的功能及作用机制提供了参考依据。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

渗透胁迫下白花柽柳消减文库的构建及分析

用PEG6000对白花柽柳进行渗透胁迫,以其叶部cDNA为试验方（tester）,正常生长的白花柽柳叶部cDNA为驱动方（driver）,利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了渗透胁迫下白花柽柳的消减文库。提取重组质粒经PCR检测,插入片段大部分集中在250～650 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如脯氨酸转移蛋白、钙依赖蛋白激酶、亮氨酸拉链蛋白、类转录起始因子蛋白等23个与渗透胁迫有关的EST,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、基因调控、活性氧清除、新陈代谢等生理生化过程。     

柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达

根据柽柳cDNA文库中获得的eIF-5A基因片段,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.cDNA长度为799 bp,编码159个氨基酸.将该cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-eIF5A.不同浓度NaCl胁迫下大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(pET28a-eIF5A)比E.coli BL21(pET28a)有明显的抗盐性,前者菌株存活率在1.0 mo1·L-1NaCl盐胁迫下是后者的9.3倍,据此认为E.coliBL21(pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与eIF-5A基因的表达相关.该基因的GenBank登录号为AY587771(基因)、AAT01416(蛋白).     

差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)基因的表达.经Reverse Northern检测,获得了7个差异表达的基因片段.其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达.序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高.本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础.     

基因芯片技术研究柽柳NaHCO3胁迫下基因的表达

运用基因芯片技术研究了NaHCO3胁迫下柽柳(Tamarix androssowii)基因的表达.将Cy5和Cy3两种荧光染料分别标记在NaHCO3处理和对照的柽柳cDNA上,将两种荧光探针混合,与载有柽柳基因的高密度芯片进行杂交并用芯片扫描系统进行扫描,通过Cy5与Cy3信号强度比值的计算研究基因的差异表达.共获得了89个差异表达的基因,其中,27个下调表达,62个上调表达.BlastX分析表明这些基因按功能可以分为光合作用、活性氧清除、渗透调节、信号传导与表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生、转运类蛋白、水通道蛋白等几大类别.同时,发现了一些与盐胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因,这些基因可能在柽柳抗盐过程中具有重要作用.揭示了柽柳的抗盐胁迫涉及的几种重要途径,并获得了NaHCO3胁迫前后柽柳基因表达谱.     

刚毛柽柳液泡膜H~+-PPase基因的克隆与胁迫下的表达分析

通过对刚毛柽柳转录组分析,鉴定获得1个液泡膜H~+-PPase基因的cDNA序列,命名为ThVP1。该cDNA序列全长3 022bp,开放阅读框为2 298bp,编码765个氨基酸,编码蛋白相对分子质量80.37kD,理论等电点5.25。ThVP1编码蛋白的疏水性较强,含有13个跨膜区。氨基酸多序列比对结果显示,ThVP1具有典型的液泡膜H~+-PPase家族3个高度保守片段(CS1、CS2和CS3),与大豆VP1氨基酸序列一致性最高,为93%。系统进化分析表明,ThVP1属于I型液泡膜H~+-PPase基因。实时荧光定量RT-PCR分析显示,NaCl和PEG胁迫下,ThVP1在柽柳根和叶中均呈现明显上调表达,表达量最高达到对照的20.9倍,暗示ThVP1可能在刚毛柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下柽柳基因的表达

运用cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下柽柳（Tamarix androssowii）基因的表达。分别将Cy5和Cy3两种荧光染料标记在干旱处理和对照的柽柳cDNA上,并与载有柽柳基因的微阵列进行杂交,通过计算机对芯片进行扫描和分析研究干旱胁迫下基因的表达。共获得了47个下调表达和62个上调表达的基因。Blastx分析表明这些基因按功能可以分为脱水保护、信号传导与调控、活性氧清除、光合作用、代谢、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生等几大类别。同时,发现了一些与干旱胁迫相关的功能未知基因和新基因。从而揭示了柽柳具有活性氧消除、代谢调节、脱水保护、蛋白质降解与再生等抗旱途径,并阐述了干旱胁迫前后柽柳基因的差异表达。     

应用SSH技术研究NaHCO3胁迫下柽柳基因的表达

以NaHCO3胁迫紫杆柽柳(Tamarix androssowii)cDNA为试验方(tester),正常生长紫杆柽柳cDNA为驱动方(driver),应用SSH技术研究胁迫下柽柳基因的表达。经Northern杂交检测,共获得36个盐胁迫应答基因。Blastx分析表明,它们编码的蛋白与下列蛋白同源：抗氧化酶CAT和PRDX;海藻糖磷酸酶(trehalose phosphatase),该酶与海藻糖合成相关;多种调控蛋白,例如bZIP转录因子、MADS-box蛋白、富含甘氨酸RNA结合蛋白(glycine-rich RNA-binding proteins)、CCCH型锌指蛋白、F-box蛋白等等;早期光诱导蛋白(early light-induced protein),该蛋白可以保护和／或修复由胁迫引起的植物光合元件(photosynthetic apparatus)损伤;半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase)和VPE(vacuolar processing enzyme),它们在植物细胞的死亡过程中起作用;以及脂质转移蛋白前体(lipid transfer protein precursor)、聚合泛素(polyubiquitin)、查尔酮合成酶、谷胱甘肽转移酶、NADPIDH、盐诱导S12蛋白、OEE1等蛋白。在获得的36个基因中,3个基因编码的蛋白分别与3个推定(putative)的蛋白即HAK2(K^ transporter)、钙结合蛋白和RNA结合蛋白具有同源性;同时,发现6个盐胁迫应答的新序列。上述结果提示柽柳的抗盐性可能不仅是依赖于盐腺的泌盐作用,而是一个多种抗盐途径和多基因协同作用的复杂体系。