内蒙古扁蓿豆野生资源形态特征研究

对产自内蒙古不同分布区12份扁蓿豆种质资源的12个形态性状进行主成分和聚类分析.结果表明,12个形态性状在材料间都表现显著差异,扁蓿豆种质资源遗传变异丰富;通过多变量的主成分分析,前6个主成分代表了扁蓿豆形态多样性的85.72％,株高、叶面积、叶长、株丛直径、枝条长和千粒重等6个性状是造成扁蓿豆表型差异的主要因素;基于形态性状的聚类分析把12份材料聚为4类,其中第4类MR-12扁蓿豆资源的株高、枝条长和株丛直径明显高于其他类,叶片大且叶量丰富,营养性状表现良好;结实性状中英果长和千粒重较大,综合性状表现较好,可以作为引种驯化和育种的试验材料.     

长江口外低氧区及其邻近海域表层沉积物反硝化微生物多样性和分布特征

【目的】微生物参与的反硝化是河口区氮损失的主要途径。【方法】本研究采用Illumina MiSeq测序方法,研究了长江口外低氧区及其邻近海域表层沉积物中nirS型和nirK型反硝化微生物群落的多样性和分布特征。【结果】样品共检测到346个nirS Operational Taxonomic Units和267个nirK Operational TaxonomicUnits,根据采样地的环境特征及nirS型和nirK型反硝化微生物群落聚类分析结果将所有OperationalTaxonomicUnits划分为低氧区、南部区域及外部深水区,其中外部深水区的样品nirS功能基因的多样性最高。各实验样地优势Operational Taxonomic Units在系统进化关系上可分为多个不同的簇。此次发现的所有优势OperationalTaxonomicUnits均属于未被培养的菌群,其中部分Operational Taxonomic Units还是首次被发现。此外还发现nirS功能基因对低氧区的环境适应性更好。【结论】我们的研究结果表明广泛存在的反硝化微生物在河口沉积物的氮循环中发挥重要作用。     

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体

目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

应激QTL座位22个微卫星标记与猪应激性状指标的 关系

摘要: 以皮特兰猪和二花脸猪为亲本建立的F2资源群体的52头猪进行2 h运输应激实验, 将仔猪出生后第3、10和17 d的“Backtest”评分(BS3、BS10、BS17)以及运输后各个体的血浆应激和代谢相关激素水平Insulin、ACTH、Cortisol、T3和T4作为运输应激性状指标。利用22个微卫星标记, 对这些应激指标进行相关性分析。结果表明: 各位点等位基因数为3~8个, 杂合度为0.4155~0.7432, 多态信息含量为0.3651~0.8150。方差分析显示: SW1808(P<0.01)和SW0320(P<0.05)对ACTH有显著影响; SW1303对Insulin、SW1092对Cortisol、SW0320对T3、S0101对T4以及SW2446对BS3影响达到显著水平(P<0.05); SW2446(P<0.01)、SW1816(P<0.05)和SW0092(P<0.05)对BS10有显著影响; SW2108、SW1816和SW1023对BS17有显著影响(P<0.05)。结果表明这11个微卫星标记对实验中的应激性状指标存在显著影响。     

重组腺病毒Ad-GFP的纯化

目的：用色谱法纯化制备携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。方法：采用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞进行病毒的扩增,冻融法裂解细胞,通过超滤、Source15Q离子交换层析和Sepharose4Fast Flow凝胶过滤层析进行分离纯化,采用分光光度法和高效液相色谱法分析重组腺病毒产品的纯度,采用组织培养半数感染剂量方法测定病毒的感染滴度。结果：通过两步色谱层析得到产品,经分光光度法分析,其D260nm/D280nm比值为1.21,高效液相色谱法分析其纯度达96.5%,产品滴度为1.0×1011U/mL,病毒颗粒数为1.76×1012/mL,比活性为5.68%。结论：确定了稳定可行的重组腺病毒色谱分离工艺,得到的产品在纯度、滴度和比活性等方面均符合国家食品药品监督管理局的标准。     

反相高效液相色谱法分析聚乙二醇修饰的水蛭素

目的：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对聚乙二醇（PEG）修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法：色谱柱为Hypersil C18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O＋0.01％的三氟乙酸,流动相B为乙腈＋0.01％的三氟乙酸。40min内由10％-50％流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL／min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果：在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论：RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。