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人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用 总被引:4,自引:0,他引:4
为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 . 相似文献
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果蝇程序化死亡基因5(PDCD5)同源cDNA的克隆和序列分析 总被引:2,自引:0,他引:2
为了解人类白血病细胞凋亡相关新基因 TFAR1 9(PDCD5,programmed cell death5)在不同种属间的序列同源性 ,利用 EST(expression sequence tag)拼接、RT- PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术 ,首次成功地进行了果蝇 PDCD5同源 c DNA编码区基因克隆和序列分析 .发现果蝇与小鼠及果蝇与人 PDCD5在核苷酸水平上分别有 57.5%和 57.1 %的同源性 ,在氨基酸水平上分别有 46.8%和 46.4%的同源性 .功能区分析发现 ,果蝇 PDCD5c DNA编码 1 33个氨基酸 ,计算机预测可能是一种核蛋白 ,含 5个可能的酪蛋白激酶 (casein kinase )磷酸化位点 ,2个可能的 PKC磷酸化位点 ,与人 PDCD5的功能区类似 .因而果蝇 PDCD5是与人 PDCD5同源的新基因 ,可能都与细胞程序化死亡相关 . 相似文献
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(一)观察了若干金属螫合剂对于SD与AHMP重组成琥珀酸氧化酶系的影响,发现它们都有明显的抑制作用。(二)粗氨酸与OP能抑制SD与AHMP的结合,而氰化钾不抑制它们的结合,但影响组成的琥珀酸细胞色素c还原酶系的电子传递。(三)从螯合剂对重组合的抑制作用可看出SD的铁在重组合中是有功用的。(四)SD与AHMP结合后,以正铁氰化钾为受体测出的琥珀酸脱氢酶活力较之结合前增加3—5倍。关于这有趣现象的原因曾加以讨论,但肯定的解释尚有待于进一步的研究。 相似文献
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本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9~9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1~8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。 相似文献
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将大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)上Lys306用基因点突变的方法分别变为Ala和Arg的密码子;得到变种基因args306KA和args306KR。变种基因重组在pUC18上,转化到大肠杆菌TG1中,转化子中ArgRS及其变种ArgRS306KA和ArgRS306KR所表达的蛋白量至少为TG1表达ArgRS蛋白量的100倍。细胞粗抽提液中ArgRS的比活TG1、转化子pUC18-args、pUC18-args306KA和pUC18-args306KR分别为1.65、210、1.8和38单位/毫克。结果表明ArsRS的Lys306为Ala取代使活力完全丧失;若被Arg取代,则活力丧失80%以上。Lys306为ArgRS活力所必需。 相似文献
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本实验室已得到的亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,与文献相比,67位氨基酸残基由His变为Arg,此酶被定名为LeuRS67R。我们从该基因与pUC19重组质粒的大肠杆菌TG1转化子TG1-91中得到LeuRS的高表达,粗抽液中LeuRS的表达量在转化子中比在宿主菌TG1中高20倍以上。用三步拉层析得到电泳一条带的酶,其比活为1789单位/毫克。测定其动力学常数,氨酰化活力对Leu、ATP的Km值分别为0.027mmol/L、0.47mmol/L,Kcat值分别为3.5~5.1s-1。ATP-PPi交换活力对Leu、ATP的Km值分别为0.03mmol/L、1.0mmol/L,Lcat值分别为140~155s-1。此结果与从野生型大肠杆菌K-12中提纯的LeuRS的动力学常数差别很小,67位氨基酸残基在与活性中心无直接关系的域可能是大肠杆菌的种间差异。 相似文献
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本文从含ArgRS306KR基因args306KR的pUC18重组质粒的大肠杆菌TG1转化子中经DEAE-Sephacel和Blue-Sepharose两步柱层析,得到电泳一条带的ArgRS306KR。纯酶的比活为2790单位/毫克。该酶氨酰化和ATP~PPi交换活力的最适pH分别为pH8.3和pH7.5。氨酰化活力对ATP、Arg和tRNA的Km分别为2.6mmol/L、14.0μmol/L和5.0μmol/L:Vmax为7630单位/毫克;koat为9S-1。ATP~PPi交换活力对ATP和Arg的Km分别为8.3mmol/L和99μmol/L;Vmax为16320单位/毫克;kcat为18S-1。 相似文献
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将cAMP依赖的蛋白激酶(cAPK)识别的特征底物序列与噬菌体外膜蛋白g3p融合,展示于线状噬菌体fd的表面,构建了cAPK底物(PKS)噬菌体.噬菌体体外磷酸化标记结果表明,PKS噬菌体上分子量约为60ku的蛋白可被明显磷酸化标记,与PKS-g3p融合蛋白的分子量一致.利用金属离子(Fe3+)配体树脂亲和筛选经cAPK磷酸化标记的Phage display随机15肽库,4轮筛选后挑取单克隆进行DNA序列测定,确定展示于噬菌体表面的多肽序列.结果表明,在所挑选的14个克隆中有5个克隆具有典型的cAPK磷酸化序列特征(R)RXS/T.对这些噬菌体的体外磷酸化标记实验结果显示,其中有(R)RXS/T序列特征的噬菌体可在分子量约60ku处被特征性磷酸化标记,与PKS噬菌体的磷酸化标记特征一致;其他有一些不具备(R)RXS/T序列特征的噬菌体也可被特征性磷酸化. 相似文献
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合成的编码大肠杆菌tRNAArg2的基因,嵌入受IPTG诱导启动子控制的质粒pTrc99B中。用上述含目的基因的质粒转化大肠杆菌MT102,得到tRNAArg2基因序列正确的克隆。诱导表达后,与受体菌相比,转化子中的tRNAArg的含量高出10倍,tRNAArg2的含量高出30倍,占总tRNA的70%。DEAESephacel柱层析后,tRNAArg2的纯度即可达到88%。再用benzylDEAEcelulose柱层析可得到纯度为99%、精氨酸接受活力为1600pmole/A260单位的tRNAArg2。从4升过夜培养液中得到的40mg总tRNA。从中可得到18mg纯tRNAArg2,产率为62%。首次精确地测定了精氨酰tRNA合成酶催化tRNAArg2时的动力学常数。 相似文献