尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定

尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用。通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F。利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达。SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2。以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

狂犬病病毒Evelyn- Rokitnicki-Abelseth疫苗株反向遗传系统的建立

摘要：【目的】建立狂犬病毒的反向遗传系统,为研制不含狂犬病病毒致病性的新型安全高效的狂犬疫苗提供技术依据。【方法】本研究采用反向遗传学方法和分子克隆技术,建立了狂犬病病毒Evelyn- Rokitnicki-Abelseth (ERA)疫苗株的CMV/ T7、T7启动子病毒拯救系统,构建了表达N、P、L蛋白的辅助质粒。【结果】成功拯救出野生型病毒rERA-VC,在Vero细胞上的生长动力学特性与父母本ERA 相同,第三代可在Vero细胞上可获得很高的生长滴度。【结论】建立了狂犬病病毒的反向遗传系统,拯救出的野生型病毒生物学特性与父母本相同。     

防风种子发芽特性及促进发芽的试验研究

防风种子发芽率和发芽势均较低,其主要原因包括个体之间的差异及物种特性。种子发芽率较低首先表现在个体发芽率上的差异,试验所用15株防风发芽率从28.0%到92.0%,从整体 上表现发芽率较低。防风本身发芽率低,由于物种因素,种子刚刚采收后的休眠,个体之间解除休眠时间和进入衰老的时间不一致,致使所有的种子不能全部在同一时间进入发芽高峰,同时,防风发芽的启动日有所差异,15株防风启动日和发芽持续时间相差均为两周以上。采用5~50 mg·kg^-1 GA、1~10 mg·kg^-1 6-BA、1%KNO₃和3%H₂O₂可提高休眠防风种子的发芽率,GA、6-BA可除防风种子的休眠,而1% KNO₃和3% H₂O₂对解除休眠的种子无明显影响。采用多种微量元素,即10~100 mg·kg^-1 Mn²⁺、10 mg·kg^-1 Cu²⁺和1 mg·kg^-1 Mo对种子进行处理可显著提高防风种子的发芽率,提示在植株绿果期喷施该类元素也可提高防风种子的发芽率。采用GA、NAA处理幼果,也可以提高种子的发芽率。     

药材道地观与中药材生产

本文阐述了现代道地中药材的概念演变,道地中药材是经过千百年来的疗效认证而普遍得到人们认可的优质中药材。通过对中药材栽培历史的分析,本文认为道地中药材的优质性主要来自野生资源。多数中药栽培发展较晚,栽培生产技术与环境结合尚未达到最优化的程度。从道地中药材成因的角度分析,野生中药材在生长年限、种质、生境、性状、成份等各方面与栽培中药材都与明显的差异,其质量也一定不同,因此对栽培中药材的道地性的应有待于进一步认识。同时,通过将现代栽培技术与中药材栽培相结合,会对栽培中药材的质量稳定和提高发挥重要作用。     

裂谷热病毒囊膜蛋白基因DNA免疫的研究

分别将裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus,RVFV)囊膜糖蛋白GN、GC和G(N C)基因亚克隆至真核表达载体pCAGGS多克隆位点鸡β-actin转录启动子下游,分别构成pCAGG-RVFV-GN、pCAGG-RVFV-GC和pCAGG-RVFV-G(N C)。免疫沉淀试验结果表明,重组RVFV蛋白GN、GC分别在pCAGG-RVFV-GN、pCAGG-RVFV-G(N C)转染HeLa细胞中获得表达,并具有良好免疫反应性。pCAGG-RVFV-GN、pCAGG-RVFV-GC和pCAGG-RVFV-G(N C)质粒DNA混合物按100μg/只剂量肌肉注射免疫6周龄BALB/c小鼠。每隔4周用相同的剂量加强免疫,第二次加强免疫3周后采血、分离血清备用。分别以杆状病毒表达RVFV囊膜蛋白GN、GC制备的抗原液包被ELISA板,间接ELISA检测DNA免疫鼠血清中RVFV囊膜蛋白G(N C)特异性抗体,具有良好的敏感性和特异性。另外,DNA免疫鼠血清中的特异抗体可有效中和RVFV囊膜蛋白G(N C)介导的伪型VSV重组病毒侵入RVFV易感宿主细胞的感染性。结果表明,pCAGG-RVFV-GN、pCAGG-RVFV-GC和pCAGG-RVFV-G(N C)质粒DNA混合物作为DNA疫苗具有防制裂谷热的潜力。     

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。     

栽培措施对龙胆产量及龙胆苦苷类成分含量的影响

为给龙胆药材生产提供栽培技术,在不同时间、以不同密度、分不同种苗等级以及在不同的前茬作物地块上移栽粗糙龙胆,秋季采用五点取样法测定产量,采用HPLC测定龙胆苦苷类成分含量.结果表明秋栽、一级种苗移栽、前茬作物为玉米,密度为125株/m2龙胆产量高,且龙胆苦苷含量都超过10.8%,但密度低龙胆有效成分含量高.秋栽、采用一级种苗移栽、轮作、移栽密度为125株/m2可达到优质高产的目标.     

龙眼成花逆转花芽α-tublin基因的克隆与原核表达

运用蛋白质组学方法比较龙眼(Dimocarpus longan Lour.)正常成花和成花逆转花芽的差异蛋白质组,并应用RACE方法克隆其中上调表达的α-微管蛋白基因α-tubulin,获得一段长度为1641 bp的cDNA,其中包括1个1350 bp的开放阅读框[GenBank登录号: FJ479617(GI：218202929)]。将α-tubulin全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得1个约49.6 kD的外源蛋白,经Western blotting验证为α-微管蛋白。RT-PCR和Western blotting分别检测了α-tubulin在转录和翻译水平上的表达, 结果表明,α-微管蛋白在成花逆转的龙眼花芽中上调表达,可能是逆转花芽形态差异表现的原因之一。     

重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分析

对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较.以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S).SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性.进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性.以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应.利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础.     

重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究

本研究构建了表达牛β干扰素的重组杆状病毒,感染sf9细胞后,分别采用免疫荧光和免疫印迹证实了重组BoIFN-β的表达存在于细胞内和培养上清中。采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV*GFP)检测分泌到细胞上清中重组BoIFN-β的抗病毒活性,可达到106.0AU/mL。同时重组BoIFN-β还可以激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达。综上,本研究采用杆状病毒表达系统,重组牛β干扰素以分泌形式高水平表达,且具有天然Ⅰ型干扰素的生物学活性。