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1.
目的优化猴源细小病毒的血凝和血凝抑制(HA/HI)试验条件,以优化的方法对160份2010年~2011年间采集于中国北京地区圈养猴群的血清样品进行猴源细小病毒抗体调查。方法 在不同的缓冲液、缓冲液pH值、猪红细胞浓度、兔血清浓度、阿氏液比例和温度下进行猴源细小病毒的HA/HI试验,选择合适的HA/HI条件。通过优化的HA/HI方法对160份猴血清进行猴源细小病毒抗体检测。结果pH 7.0、0.02 mol/L PBS、0.75%猪红细胞、0.5%兔血清和4℃可作为猴源细小病毒HA/HI试验合适的反应条件,猪血球以1∶1阿氏液抗凝,可保存5~7 d不影响实验结果。猴血清的猴源细小病毒抗体阳性率为58.1%。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。细小病毒在我国北京地区圈养猴群中感染比较普遍。  相似文献   
2.
狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备   总被引:1,自引:0,他引:1  
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。  相似文献   
3.
【目的】本试验前期已经证实,用单链抗体(sc Fv)-绿脓杆菌跨膜区(ETA)-酵母DNA结合结构域(GAL4)表达的蛋白(简写为SEG蛋白),SEG能与含sh RNA(short hairpin RNA)的质粒(p RNATU6.3-sh RNA)结合形成复合物SEG-sh RNA,并靶向运送该质粒进入感染狂犬病毒(Rabies virus,RV)的细胞,抑制RV复制。本研究用感染狂犬病病毒的小鼠模型,进行SEG-sh RNA复合物小鼠体内靶向性运送si RNA(short interfering RNA)和抑制RV复制的研究。【方法】用已建立RV CVS-24株小鼠肌肉注射模型进行试验。取50 LD_(50) CVS-24攻毒,在攻毒后12 h尾静脉注射SEG-sh RNA,流式细胞仪检测SEG-sh RNA的体内靶向性;同样方法攻毒后,尾静脉注射SEG-sh RNA,连续4 d,攻毒后第5天小鼠脑组织用q RT-PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测其中RV的含量;统计小鼠存活率;并检测小鼠体内IFN-α含量,从而分析SEG-sh RNA在体内的抗病毒作用。【结果】结果表明仅在RV攻毒小鼠的注射部位检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,未注射RV的腿部及脑、肝、脾、肾均无GFP表达,说明SEG-sh RNA可靶向RV感染细胞运送sh RNA。攻毒后第5天脑组织q RT-PCR结果表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍(3.9/0.8);RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色试验结果表明使用SEG-sh RNA组病毒量明显少于病毒对照组;且攻毒后13 d,动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-α未见升高。【结论】以上试验表明SEG蛋白在小鼠体内靶向运送含sh RNA的质粒到感染组织细胞;对小鼠体内RV有明显抑制作用,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。  相似文献   
4.
构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体。从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOE-PCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性。结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础。  相似文献   
5.
肉食兽细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属中的一类病毒,能够感染多种动物,导致犬的出血性肠炎、幼龄犬的心肌炎、猫的白细胞减少、出血性肠炎、幼龄猫的共济失调症以及水貂的肠炎等多种疾病.血清学调查发现,由肉食兽细小病毒引起的疾病存在于世界各地.在我国,无论是家养还是野生动物均有细小病毒相关疫病的流行,对我国犬科和猫科动物的生存和健康构成巨大威胁(许树林等,1996;宋桂强等,2007).  相似文献   
6.
为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性.采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显著(P< 0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16.研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础.  相似文献   
7.
将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29%。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96%的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。  相似文献   
8.
为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。  相似文献   
9.
【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)-ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果。【结果】克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL。ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关。细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制。【结论】SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制。  相似文献   
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