Pichia Pastoris表达系统的启动子研究进展

Pichia Pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白.启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达.本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展.     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析

目的：应用P.pastoris的pAOX1表达系统胞内表达canstatin-N蛋白。方法：通过PCR DNA合成技术以及DNA的酶切和连接技术,除去pPIC9K分泌型表达载体的信号肽,并使其载体的多克隆位点的3′端融合his6纯化标签,获得新的载体pPIC9Ki。以含canstatin N端序列的pET-CTN质粒为模版,PCR法扩增1～89个氨基酸的267bp的canstatin的N端基因片段,将其连接于pPIC9Ki的多克隆位点,获得重组表达质粒pPIC9Ki-CTN-N,用电转法将pPIC9Ki-CTN-N转化P.pastorisGS115,通过G418抗性筛选获得工程菌GS115（pPIC9Ki-CTN-N）。通过摇瓶发酵甲醇诱导表达Canstatin-N蛋白。用蜗牛酶裂解P.pastoris细胞,SDS-PAGE分析蛋白表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果：在pAOX1的调控下,canstatin-N基因能在P.pastoris中经甲醇诱导表达,摇瓶发酵表达量为65mg/L,纯化的目的蛋白具有显著的抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论：实现应用P.pastoris表达Canstatin-N蛋白,为Canstatin-N蛋白的规模化生产和进一步的药用研究奠定了基础。     

楔天牛属7种雄性外生殖器特征比较研究

本文研究了检疫截获的楔天牛属7种楔天牛八点楔天牛、白桦楔天牛、斑点楔天牛、柳楔天牛、青杨楔天牛、山杨楔天牛、十星楔天牛雄性外生殖器的形态结构,并提供其解剖图。研究表明,楔天牛属雄性外生殖器由阳茎基、中茎和内囊3部分组成。阳茎基的阳基侧突具有相对遗传稳定性,且在属内均成近似矩形,并首次测量了7种楔天牛的成虫雄性外生殖器阳基侧突的长宽比。得出了雄性外生殖器形态特征在楔天牛属种内差异小、种间差异大,并能用雄性外生殖器特征有效区分楔天牛属近似种的结论。     

钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的：利用毕赤酵母表达系统表达Calreticulin-N58蛋白。方法：利用重叠延伸PCR方法合成Calreticulin-N58基因，构建成分泌型的重组表达载体pPIC9K-CRT-N58。该重组表达载体经SacI线性化后，电激转化入毕赤酵母GSll5，经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株。经甲醇诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况，在鸡胚中进行活性分析。结果：重组质粒pPIC9K-CRT-N58在毕赤酵母中经甲醇诱导能分泌表达CRT-N58蛋白，摇瓶表达量大约为60mg／L，纯化的目的蛋白有显著的血管生成抑制作用。结论：实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达。为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。