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1.
用双引物法对GI基因进行体外定点突变,构建了突变体Q20L和G247D。含突变基因的重组表达质粒pTKD-GIQ20L及pTKDGIG247D在E.coli K38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比:(1) GIQ20L的最适反应温度下降5℃,热稳定性为野生型酶的78%,对底物的亲和性增强;(2) GIG247D的酶活提高约33%,最适pH下降0.6个单位,但热稳定性降低。初步分析认为,Gln 20位于α0~α1螺旋之间,其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后,分子表面增强的疏水作用,反而不利于蛋白质的稳定,使GIQ20L的热稳定性降低。Gly247是酶活性中心β折叠(242~247aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后,可能改变分子的静电场分布,影响了活性部位的电荷传递过程,使GIG247D酶活提高。引入的电荷,可能改变活性中心可解离基团的pKa,使其最适pH下降。另外Asp247的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤,易与其他侧链产生排斥,由此影响到β-折叠的稳定性,接近亚基结合面的Asp247,可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性,最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。  相似文献   
2.
葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se…  相似文献   
3.
以双引物法对葡萄糖异构酶(GI)基因进行定点突变,将突变体基因于大肠杆菌中表达,获得了GI双点突变体GIK253RA198C.研究K253R和A198C双点突变对GI的结构和性质的作用,结果表明GIK253RA198C的热稳定性明显下降,最适反应温度降低5℃.文章从结构和机制上解释了为何同是K253R突变,对SM33 GI和密苏里游动放线菌GI的热稳定性产生不同的影响,认为这是由于Lys253在两种GI结构的位置上存在微小差异,从而使引入的Arg对亚基间的相互作用产生了相反效应所引起.  相似文献   
4.
7号淀粉酶链霉菌M1033菌株木糖异构酶晶体结构研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
7号淀粉酶链霉菌M1033菌株木糖异构酶(SDXyI).19nm分辨率晶体结构已经解出.晶体空间群为I222,晶胞参数为a=9.884nm,b=9.393nm,c=8.798nm.参考锈赤链霉菌木糖异构酶(SRXyI)的晶体结构模型,通过分析晶体密堆积关系和晶体学R因子搜索,获得了SDXyI晶体结构的初始模型.采用PROLSQ软件包使用0.60~0.19nm分辨率衍射数据对模型进行了修正.最终模型的晶体学R因子为0.177,键长键角均方根偏差分别为0.0019nm和2.1°.与SRXyI相比较,SDXyI整体构象未发生明显变化,活性中心构象有显著差异.  相似文献   
5.
由SDS及梯度胶电泳测得油桐尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白天然状态及亚基分子量分别为363kD与31.5kD,从而推断此蛋白为十二聚体,亚基间无二硫键作用.BsNPV多角体蛋白的远紫外圆二色谱显示,它的二级结构含有31.7%的α螺旋,23.8%的β折叠及44.5%的无规卷曲,与二级结构预测结果相符.通过荧光光谱实验推知,BsNPV多角体蛋白的表面疏水性弱,其色氨酸残基位于蛋白疏水核内部.  相似文献   
6.
从皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)毒液中经DEAE-Sepharose和SephacrylS-200两步凝胶柱层析首次纯化出一种中分子量出血毒素(简称AaHⅣ).经SDS-PAGE和等电聚焦凝胶电泳测定其分子量为44kD,等电点为pH5.0.从500mg粗毒中可获得20mgAaHⅣ纯品.AaHⅣ有较强的出血活性,最小出血剂量(MHD)为0.4μg.  相似文献   
7.
The crystal structures of Streptomyces diastaticus No. 7 strain M1033 xylose isomerase (SDXyI) have been analysed and refined at 0.19nm. The crystal space group is I222, with unit cell dimensions of a=9.884 ran, b=9.393nm and c=8.798nm. Based on the coordinates of the Streptomyces rubiginosus xylose isomerase (SRXyI), the initial model of SDXyl was built up by the dose packing analysing and R-factor searching and refined by PROLSQ to a final R-factor of 0.177 with the rms deviations of bond lengths and bond angles of 0.001 9nm and 2.1°, respectively. No significant global conformation change existed between SRXyI and SDXyI except the local conformation in the active site.  相似文献   
8.
在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子Ⅰ的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。  相似文献   
9.
为了发展优良的链霉菌宿主系统 ,以带有硫链丝菌素抗性的同源重组葡萄糖异构酶 (GI)缺陷型菌株M10 33XW78,M10 33XW194为出发菌株 ,利用摇瓶、影印和负筛的方法 ,获得一株既无GI活性又对硫链丝菌素敏感的回复菌株 ,命名为淀粉酶链霉菌M5 3.通过染色体PCR检测、酶切图谱鉴定、序列分析等方法 ,确认M5 3含有和M10 33一致的 1 2kb葡萄糖异构酶基因 ,但在结构基因345~ 10 95bp片段内有 17个碱基发生突变 .这说明在染色体内自发同源重组过程中 ,有低频率的突变位点引入 .酶活力测定和SDS PAGE分析表明 ,该突变的GI基因不表达 4 2 5KD葡萄糖异构酶 ,这为M5 3菌株发展成为优良的链霉菌宿主提供了足够的表达空间 .一系列的转化实验也证明了M5 3菌株很可能是一种新型链霉菌克隆受体  相似文献   
10.
在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子I 的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。  相似文献   
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